草酸降解菌基线丰度决定Oxalobacter formigenes益生菌疗法应答效力的机制研究

本研究发现肠道微生物中草酸降解基因（frc/oxc）的基线丰度是预测Oxalobacter formigenes益生菌疗效的关键指标。通过饮食干预和微生物组分析，研究揭示了基线降解能力与尿草酸降低幅度的负相关性（R=-0.42, p<0.001），为高草酸尿症（Hyperoxaluria）的精准微生物治疗提供了直接证据，解决了既往临床试验结果不一致的难题。

　　

ABSTRACT

草酸作为来源于饮食和代谢的化合物，与多种肾脏和血管疾病相关。特定肠道细菌可通过降解草酸来限制其吸收并促进分泌。本研究探讨了影响专性草酸降解菌Oxalobacter formigenes降低尿草酸水平的微生物因素。通过分析26名健康非结石成人的肠道菌群数据（采用16S rRNA和草酸降解基因oxalyl-CoA decarboxylase（oxc）与formyl-CoA transferase（frc）的高通量测序及qPCR技术），发现基线草酸降解基因丰度与粪便草酸（frc: R=?0.43; oxc: R=?0.34）、尿草酸水平（frc: R=?0.25; oxc: R=?0.27）及O. formigenes给药后尿草酸降低幅度（frc: R=?0.36; oxc: R=?0.42）均呈显著负相关。该研究首次提供直接证据表明基线草酸降解基因丰度可预测益生菌疗效，为解释临床试验结果不一致现象及实现基于精准微生物组的高草酸尿症治疗提供了理论基础。

Introduction

草酸广泛存在于植物性食物中，并由肝脏内源性产生。其水平升高与慢性疾病如尿石症（USD）、慢性肾病（CKD）、终末期肾病（ESRD）、血管钙化和心肾代谢综合征（CKMS）密切相关。高草酸尿症（成人尿草酸排泄>40 mg/d）会增加疾病风险，而较低排泄水平也可能与CKD进展相关。由于哺乳动物无法降解草酸，其清除依赖尿液排泄或肠道特定细菌的降解作用。

肠道细菌通过多种代谢途径降解草酸，其中oxlT基因编码草酸-甲酸逆向转运蛋白，常与frc（甲酰辅酶A转移酶）和oxc（草酰辅酶A脱羧酶）基因协同作用，将草酸逐步转化为CO₂和甲酰辅酶A。O. formigenes作为经典草酸降解菌，但其临床干预试验结果存在显著差异。本研究旨在确定预测O. formigenes益生菌治疗效果的微生物因素，重点关注其他草酸降解菌的影响。

Materials and methods

Study design and participant recruitment

研究采用饮食对照临床试验设计（NCT03752684），参与者经过血清代谢 panel 和24小时尿肌酐筛查。排除标准包括异常实验室值、近期抗生素使用、肾结石病史及BMI或肾功能极端值。通过粪便培养和O. formigenes特异性PCR确认未定植者入选。饮食方案包括低草酸（~50 mg/d）正常钙和高草酸（~230 mg/d）低钙阶段，后口服~10¹⁰活菌诱导定植。

Controlled dietary interventions

标准化饮食阶段收集粪便和24小时尿液样本，采用离子色谱-质谱法（IC-MS）测量草酸水平。高草酸饮食阶段用于评估 colonization 后尿草酸变化。

Stool sample collection and DNA extraction

粪便样本于?80°C冷冻保存，使用KingFisher Duo Prime系统提取DNA。共分析224份样本（高草酸饮食122份，低草酸饮食102份）。

High throughput sequencing

通过515F/806R引物扩增16S rRNA基因V4区，frc基因采用保守引物frc-171F/frc-306R进行测序。使用DADA2进行质控和ASV分配，SILVA 138和NCBI数据库进行注释。系统发育分析通过phangorn完成，BWA映射基因组进行 taxonomic 注释。

qPCR of oxalate-degrading genes

通过qPCR定量16S rRNA、oxc和frc基因丰度，引物针对多 taxon 背景设计。数据以log2转换并标准化至16S rRNA拷贝数。

Statistical analysis

采用R语言进行Pearson相关性分析、ANOVA和DESeq2差异丰度检验。Alpha多样性基于未加权系统发育多样性，Beta多样性通过加权UniFrac和PERMANOVA评估。

Results

Results of patient screening

38名初筛者中12人排除，最终26人符合标准。1人退出后，22人完成试验。

Dietary oxalate intake strongly influences urinary oxalate excretion

高草酸饮食显著增加粪便和尿草酸水平，验证了饮食干预模型的有效性。

Baseline abundance of oxalate-degrading genes negatively correlates with stool and urine oxalate levels and the response to O. formigenes colonization

基线frc和oxc基因丰度与粪便草酸（frc: R=?0.43, p<0.001; oxc: R=?0.34, p<0.001）、尿草酸（frc: R=?0.25, p=0.008; oxc: R=?0.27, p=0.004）及 colonization 后尿草酸降低幅度（frc: R=?0.36, p<0.001; oxc: R=?0.42, p<0.001）均呈负相关。低应答组尿草酸平均降低4%，而高应答组降低24%。

Diversity of frc-containing bacteria and the whole gut microbiota

frc基因携带菌以Nonomuraea、Pseudoduganella和Streptomyces为主，约占肠道菌群的5.7%。frc系统发育多样性与估计胃肠道草酸吸收（R=?0.21, p=0.024）及益生菌响应（R=0.22, p=0.016）相关，但与粪便/尿草酸无显著关联。整体菌群组成与所有草酸指标显著相关（p=0.001）。Spearman分析发现Bradyrhizobium、Kribbella等frc类群及Alistiipes、Bacteroides等全菌群类群与草酸代谢指标显著相关。

Discussion

研究表明基线草酸降解基因丰度（非多样性）是预测O. formigenes疗效的关键因素，这解释了既往临床试验的不一致性。结果与野生啮齿类动物研究一致，强调了在自然高草酸饮食模型中研究的价值。尽管存在局限性（小样本、仅检测frc/oxc基因、未评估宿主遗传因素），但本研究为高草酸尿症的精准治疗提供了微生物生物标志物。未来需探索联合疗法（如SCFA生产者或胆汁酸调节菌）及在临床人群中的验证。

Conclusions

基线草酸降解菌水平显著影响O. formigenes益生菌疗效。定量评估oxc/frc基因丰度（而非仅检测O. formigenes）对患者分层和治疗策略制定具有重要临床意义。

Acknowledgments

感谢技术支持及NIH基金（R01DK087967等）资助。

Author contributions

JK、DGA和SF设计临床研究；MS、AWM和JK设计本研究；MS完成实验；AWM、AF和MS分析数据。

Disclosure of potential conflicts of interest

无利益冲突。

Data availability statement

测序数据保存于PRJNA1051530。