热带河口食物网中多环芳烃（PAHs）生物累积模式与物种特异性毒理响应研究

本研究系统探讨了尼日利亚Cross River河口不同污染程度下热带水生生物对多环芳烃（PAHs）的生物累积特征及其诱导的氧化应激（GPx、GR）与生物转化（EROD、MROD、BROD、PROD、GST、UDPGT）响应，揭示了污染物分布与生物标志物间的显著关联性，为发展中国家河口生态风险评估提供重要依据。

　　

ABSTRACT

本研究旨在调查尼日利亚Cross River河口三个不同人为污染程度站点（Adiabo对照点、Obutong和Nsidung）热带河口食物网中多环芳烃（PAHs）的氧化应激、生物转化和生物累积特征。研究对象包括鱼类（Chrysicthys nigrodigitatus）、招潮蟹（Uca tangeri）、蓝蟹（Calinectis amnicola）、虾（Macrobrachium vollenhovenii）、海螺（Tympanotonus fuscatus）及沉积物样本。通过测定肝脏氧化应激和生物转化酶活性——谷胱甘肽 peroxidase（Gpx）、谷胱甘肽 reductase（Gr）、谷胱甘肽 S-transferase（Gst）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（Udpgt）、7-乙氧基-、甲氧基-、戊氧基-和苄氧基试卤灵O-脱乙基酶（EROD、MROD、PROD和BROD）以及PAHs水平，发现污染站点（Obutong和Nsidung）的生物群与沉积物中存在物种和站点特异性的毒理学效应。与对照点Adiabo相比，污染站点的生物群中EROD、MROD、BROD、PROD活性及GPx、Gr、Gst、Udpgt均显著升高。这些生物标志物响应与Obutong和Nsidung的PAHs累积趋势一致，表明PAHs暴露诱导了氧化和生物转化生物标志物响应。主成分分析（PCA）显示变量间显著关联，表明站点是决定生物群（鱼类、蟹类、虾类和海螺）污染物吸收和生物标志物响应的主要因素。数据证明了沉积物和热带河口食物网中PAHs的站点和物种特异性分布及浓度，以及对定居生物群相应的生物转化和氧化应激响应。这些热带食物网中检测到的PAHs浓度表明存在严重的人类食品安全和环境健康问题。

Introduction

多环芳烃（PAHs）及其他持久性有机污染物（POPs）的持续无规释放导致多重复杂的环境压力，对热带生态系统具有显著的生态和公共健康关切。PAHs是由两个或多个稠合芳香环组成的特定毒性化合物，广泛存在于多种环境基质中。由于其潜在快速代谢特性，这类化合物被认为是最优先的环境污染物，因其能够在水生食物鱼种和食物网中生物累积和生物放大。PAHs输入水生生态系统的来源主要包括石油源（petrogenic）、不完全燃烧过程（pyrogenic）、有机代谢（biogenic）及沉积物转化过程（diagenetic），其中石油源和燃烧源是水生环境PAHs污染的重要贡献者。此外，原油开采和勘探活动（包括泄漏和非法bunkering）被确定为水生和陆地生态系统中PAHs污染的主要来源。

尽管全球多个区域已有关于水生食物鱼种中PAHs污染的数据，但由于研究能力和基础设施有限，来自尼日利亚等中低收入国家的PAHs介导毒理响应报告较少。这些问题在这些原油资源丰富地区因环境法规和执行薄弱而加剧。物种特异性PAHs介导毒理响应提供了整体生物监测方法，并从发展中国家角度显著促进全球水生生态系统健康生态毒理监测。因此，理解个体物种水平差异及其污染物生物转化和代谢机制可能有助于设计更好的生态毒理监测动物模型和方案，从而增进我们对环境和生物健康的理解。

这类污染物据报道对暴露生物产生广泛毒理、生理和代谢效应，包括致癌、免疫毒性、肝损伤、DNA甲基化、致畸和致突变效应。其他研究者证明了PAHs在多个食物链和网中的营养动态和转移。此外，生物暴露于这些外源物质会激活生理过程，旨在代谢和可能消除这些化学污染物，这一生物过程称为生物转化。在生物转化过程的第一阶段（phase I），母体化合物通过添加羟基（OH）集团功能化；在第二阶段（phase II），功能集团与内源性分子之间形成共价连接，产生水溶性结合物，促进外源化合物排泄。生物中CYP酶的诱导（以EROD、PROD、MROD和BROD测量）在生物转化过程中起重要作用，参与解毒和/或生物活化机制，这对生态毒理监测和健康后果至关重要。此外，Huang等指出鱼类生物转化和氧化应激响应酶活性的变化作为对包括PAHs在内的多种污染物环境暴露的早期敏感生物标志物。多种环境污染物包括PAHs是促氧化应激物，诱导细胞内活性氧物种（ROS）产生，导致氧化应激。这是因为参与氧化应激防御网络的多种酶通常作为抗氧化剂功能，包括谷胱甘肽 peroxidase（GPx）、谷胱甘肽 reductase（GR）、谷胱甘肽 S-transferase（GST）和UDP-glucuronosyltransferases（UDPGT）。因此，生物转化和氧化应激酶的诱导被采纳为生态毒理监测中环境暴露的敏感可靠生物标志物。其他研究者发现PAH暴露导致斑马鱼全局DNA甲基化，而特定PAH同系物浓度与亚得里亚海意大利蠵龟的氧化、生物转化响应和全局DNA甲基化生物标志物响应正相关。

Calabar河是尼日利亚南部生态和经济上重要的河流，接收未经处理的工业、农业和生活污水复杂混合物。由于其作为进入大西洋的门户的战略位置，该河在尼日利亚南部扮演重要经济角色，作为原油开采和勘探的主要路线，包括石油泄漏和非法bunkering。此外，Calabar河是主要渔场和渔业，包括多种水生食物鱼的繁殖和育幼场。因此，由于尼日利亚环境法律执行和监管不力，Calabar河被认为污染严重。先前，已有关于环境扰动包括气候变化和该河鱼类组合生态分布的影响报告。其他研究者确定了该河生物群、水和沉积物样本中多种新兴和再现环境污染物的出现和分布。尽管有这些关于这些污染物出现和浓度的报告，关于定居生物群的生物标志物响应信息有限或不存在。目前，尼日利亚Cross River河口热带河口食物网中特定PAH同系物与催化生物转化和氧化应激响应的关系未知。因此，本研究旨在调查尼日利亚Cross River河口热带河口食物网中氧化应激和生物转化响应与PAHs生物累积的关系。这项研究构成持续综合努力的一部分，旨在从发展中国家角度开展热带水生食物鱼种生物标志物开发和验证，以实现可持续环境、食品安全和人类健康管理。

Materials and methods

Chemicals and reagents

所有化学品和试剂均为最高商业可用等级。

Study area

Calabar河是Cross River河口的一部分，位于尼日利亚南部热带雨林带，介于北纬4°54′至5°50′和东经8°至8°20′之间。该河由尼日利亚港务局（NPA）疏浚以供海船航行，海岸线由软黑泥滩组成，低潮时通常裸露。Calabar河为半日潮，潮差3?m，估计长度65?km，最大宽度1.5?km。该河是工业（包括石油勘探和开采）、农业、生活污水和地表径流的重要接收者。沿Calabar河长度选择了三个采样站：Adiabo（假定对照点，无可见工业、农业和生活输入）、Obutong（重工业站点，接收石油工业/油罐场、水泥厂和生活污水的点和扩散源 effluent）和Nsidung（接收农业和生活来源 effluent）。水物理化学条件为温度：26.24?±?0.61°C；pH：6.52?±?0.21；溶解氧（DO）：4.42?±?0.13?mg/L。

Sample collection and preparation

2022年3月至4月07:00–14:00?时期间，借助 artisan 渔民使用刺网和抛网（网目尺寸50-55?mm）在不同采样点采集了总计253个鳍类和贝类样本，包括C. nigrodigitatus（n?=?44）、招潮蟹（U. tangeri；n?=?21）、蓝蟹（C. amnicola; n?=?24）、虾（M. vollenhovenii；n?=?42）、海螺（T. fuscatus；n?=?122）。采样站为Adiabo（n?=?62）、Obutung（n?=?93）和Nsidung（n?=?98）。采集的生物群根据Idodo-Umeh鉴定，并在冰上用MS-222（三卡因甲磺酸盐）麻醉。提取肝脏样本，部分在液氮中速冻用于酶测定。还从三个采样点采集鱼类肌肉样本于铝箔中，用于PAHs分析。使用van Veen抓斗从三个站点三重采集沉积物样本于铝箔中，进一步制备分析。

Fish morphometric measurements

鱼体测量数据——全长（cm）、体重和性腺重（g）分别用数字游标卡尺（Tresna Instruments）和奥豪斯（Metler Instruments）测量。计算条件因子（CF），而器官体细胞指数计算为器官重与总体重相关，以百分比（%）表示。

Preparation of post-mitochondrial fraction (PMF) and enzyme activity assays

取500?mg个体肝脏样本，用0.1?M磷酸钠、100?mM EDTA、1?mM二硫苏糖醇和10%甘油缓冲液（pH 7.4）以1:4（肝脏:缓冲液）比例 homogenized。 homogenized 样本在4°C下12,000 ×g离心20?min。

测定 phase I（EROD、BROD、PROD和MROD）和 phase II生物转化酶（Gst和Ugt）活性以及氧化应激（Gr和Gpx）活性。所有酶活性均针对Bradford测定的总蛋白浓度归一化，以牛血清白蛋白（BSA）为标准。

Chemical analysis

通过高效液相色谱（HPLC）配二极管阵列和荧光检测常规程序测量鱼类肌肉、蟹类、虾类和海螺全身及沉积物中的PAHs。

Statistical analysis

所有数据以均值?±?标准误表示，并使用Origin 8软件进行单因素ANOVA，数据集正态分布用Shapiro-Wilks检验分析，而方差齐性用Levene检验确定。使用主成分分析（PCA）评估采样点间生物变量（酶响应）与化学污染物组（PAHs）的关系。使用Statistica^TM for Windows版本8.0提取主成分和双标图。

Results

Biotransformation and oxidative stress biomarker responses

Phase I（EROD、BROD、PROD和MROD）和II（GST和UDPGT）生物转化及氧化应激（GPx和GR）生物标志物响应在Calabar河三个采样点采集的鱼类（C. nigrodigitatus）、招潮蟹（U. tangeri）、蓝蟹（C. amnicola）、虾（M. vollenhovenii）、海螺（T. fuscatus）样本中测定，显示跨站点生物标志物响应的可变和动态差异。与上游对照Adiabo相比，下游站点Obutong和Nsidung的U. tangeri, M. vollenhovenii, T. fuscatus, and C. nigrodigitatus中EROD活性显著更高。类似地，与Adiabo相比，Obutong和Nsidung的C. nigrodigitatus, U. tangeri和M. vollenhovenii中MROD活性显著升高。然而，C. amnicola在对照Adiabo站点表现出显著更高的EROD活性。对于BROD活性，与Adiabo相比，Obutong和Nsidung的C. nigrodigitatus, U. tangeria以及Obutong的M. vollenhovenii中观察到显著增加。此外，与Adiabo相比，下游Obutong和Nsidung的C. nigrodigitatus, U. tangeri and M. vollenhovenii中PROD活性显著升高。

氧化应激生物标志物响应（GPx和GR）显示跨Calabar河不同站点的可变和显著上升，与Adiabo相比，GPx活性在Obutong和Nsidung的C. nigrodigitatus、Nsidung的C. amnicola、Obutong的M. vollenhovenii中显示显著增加。对于GR，与Adiabo相比，所有检查物种（C. nigrodigitatus, U. tangeri, C. amnicola, M. vollenhovenii和T. fuscatus）在Obutong和Nisdung中均观察到显著更高活性。Phase II生物转化响应仅在C. nigrodigitatus中GST活性显著增加，主要是在Obutong；而UDPGT活性在所有物种中均显著升高，主要是在Obutong，除了C. Amnicola。

PAHs levels in sediment and biota

总PAHs（Σ₁₉PAHs）、高和低分子量（HMW和LMW）显示所有站点包括对照站点Adiabo的沉积物中存在，Obutung的丰度水平显著高于Nsidung，后者又高于Adiabo。在沉积物和生物群样本中检测到PAHs，包括C. nigrodigitatus, U. tangeri, C. amnicola, M. vollenhovenii和T. fuscatus。除苊烯、1-甲基萘、苊、二苯并(ah)蒽和茚并(123?cd)芘未在Adiabo和Obutong沉积物样本中检测外，所有测量沉积物PAHs浓度包括低和高分子量PAHs在Obutong和Nsidung均显著高于Adiabo。总PAHs（Σ₁₉PAHs）总和显示站点特异性浓度，Obutong（197.9?±?5.9 ng/g）和Nsidung（61.5?±?4.3 ng/g）记录较高水平，而Adiabo为（29.6?±?2.3 ng/g）。在生物群中，评估物种间PAHs动态存在变异性。有趣的是，对于C. nigrodigitatus（鱼）肌肉，Σ₁₉PAHs、HMW和LMW水平在Adiabo（对照）显著高于污染站点Obutung和Nsidung。

对于无脊椎动物（U. tangeri, C. amnicola, M. vollenhovenii），Σ₁₉PAHs浓度在Obutong和Nsidung显著高于Adiabo，后者也显示相对较高浓度水平。总体而言，无脊椎动物在Adiabo显示多种PAH同系物的可变浓度，某些情况下甚至高于污染站点Obutong和Nsidung。

Principal component analysis (PCA)

提取的主成分（PC）、变异百分比、站点、生物标志物（生物转化和氧化应激响应）与生物群PAHs负荷关系的PCA双标图说明。由于本研究测量了多种生物标志物响应、站点和污染物（PAHs）变量，变量PCA双标图分离为两个PC，显示污染物、站点和测量生物标志物响应间的不同关联。提取两个主成分，分别占整个数据集总变异的59%和60%，并显示站点、PAHs和生物标志物响应的不同分组。对于两个PCA，PC1分别占37.2%和40%，变量在排序空间排列，明显表明站点是决定鱼类、蟹类、虾类和海螺污染物生物累积和生物标志物响应的主要因素。例如，所有来自Obutong的生物群样本显示与污染物水平（PAHs）和生物变量（生物转化和氧化应激响应）正相关。

Discussion

由于污染物在水生生物群和沉积物中的持续无规释放、吸收和生物累积导致的环境污染仍是现代文明最大全球祸害之一。环境在维持生态系统生命方面扮演重要角色，所有生物群依赖环境资源生长发展、繁殖和明显生存。目前，多重环境压力如气候变化、污染（水和空气）已增加，随之对生计、全球经济、政策产生影响，并导致媒介和疾病负担增加，带来严重公共健康后果。

人为活动被认为是污染的重要驱动因素，这些化学污染物持续输入生态系统代表严重社会关切。对发展中国家，大多数这些污染水生生态系统构成主要饮用水源，并常用于其他生活活动包括烹饪。此外，水生食物物种是廉价蛋白质来源的主要组成部分，组织污染物负荷突出潜在公共健康和食品安全关切。本研究调查了尼日利亚Cross River河口热带河口食物网中PAHs生物累积水平相关的毒理响应。数据证明所有研究站点（Adiabo（假定对照）、Obutong和Adiabo）沉积物和河口食物网（鱼类、蟹类、虾类和海螺）中PAHs浓度显著较高，导致 phase I-和II-生物转化和氧化应激生物标志物响应增加。使用PCA，结果证明这些重要河口食物网中PAHs水平与生物标志物响应间因果关系，表明沉积物和组织PAHs负荷与毒理响应间强关联。

一系列化学污染物被发现对生物转化和氧化响应产生效应，并涉及外源化合物的解毒和随后消除和/或活化。CYP酶代谢多种化合物，这些反应进一步通过UGT和GST与内源性分子结合，作为外源物质失活、活化、解毒和消除的主要途径。我们的调查检查了Calabar河河口食物网（鱼类、蟹类、虾类和海螺）中的生物转化和氧化应激响应，注意到与对照（Adiabo）相比，Obutong和Nsidung这些生物的EROD、MROD、BROD和PROD）、II（UDPGT和GST）和氧化应激（GPx和GR）酶响应显著升高。此外，我们的研究证明这些生物标志物活性中的物种和站点特异性响应与生物群和沉积物PAHs浓度平行。与我们发现一致，生物转化和氧化应激诱导与PAHs暴露相关，如其他研究者证明。

PAHs的生物转化机制与芳烃受体（AhR）相关，后者调节多种细胞活动包括外源代谢酶。PAHs与AhR结合启动P450酶诱导，导致生物转化过程，因此被认为是PAHs生物转化的第一步。本研究注意到EROD、BROD、MROD和PROD催化活性的某些物种和站点特异性变异和动态；然而，这并不意外，考虑到这些采样点独特和不同程度的人为污染。此外，本研究发现CYP酶诱导中观察到的变异和动态可能表明研究环境中存在其他CYP诱导化合物。我们的发现支持现有知识，表明Calabar沉积物和生物群样本中存在其他CYP诱导污染物，如PCBs和OCPs。与我们数据一致，几位先前研究者证明污染水体水生生物中催化和转录生物转化响应诱导。

Phase II生物转化酶（GST和UDPGT）启动功能集团与可溶性结合物间共价连接，用于解毒和可能消除。本研究中，与对照站点Adiabo相比，Obutong和Nsidung生物群中检测到GST和UDPGT的站点和特异性显著诱导。这一观察可能反映这些站点存在的PAHs和其他 phase II诱导污染物水平，并表明这些物种增强代谢、解毒和可能消除这些污染物。Regoli和Giuliani确定抗氧化防御系统是 against 氧化应激和损伤的保护系统网络。响应和诱导与生物暴露于多种环境污染物组后自由基产生相关，这些自由基在 against 污染物介导氧化应激的细胞保护中起重要作用。外源物质生物转化涉及多种基因，由AhR调节并被各种外源和内源分子激活。CYP酶调节多种底物的氧化代谢，具体地，Cyp1、2和3酶超家族代谢多种平面化合物，产生作为 phase II酶（Ugt和Gst）底物的代谢物，随后失活和消除亲脂性外源物质。cyp1同工型、Ugt和Gst表达由配体激活AhR控制。由于Cyp酶在外源物质解毒和活化中的整体作用，其表达和活性变化影响外源物质代谢的可能风险和益处，并通过监测相关环境健康评估。我们的发现证明抗氧化响应（GPx和GR）显著上升，与Obutong和Nsidung生物群中PAHs水平升高平行，表明 against PAHs介导ROS氧化应激的可能适应和保护响应。与我们观察一致，几位研究者报告污染物诱导ROS产生，对暴露生物产生 resulting 氧化效应。

使用PCA，数据证明变异百分比， delineated 站点、生物标志物（生物转化和氧化应激响应）和污染物（PAHs）负荷关系在生物群（鱼类、蟹类、虾类和海螺）中。提取两个主成分，变量在排序空间显示固体指示站点是污染物吸收和生物标志物响应在鱼类、蟹类、虾类和海螺中的重要因素。例如，所有来自Obutong的生物群样本显示与污染物水平（PAHs）和生物变量（生物转化和氧化应激响应）正相关，这一观察可能表明站点、PAHs浓度和生物群生物标志物响应间因果关系。

整体视图呈现数据证明Obutong和Nsidung的站点和物种特异性PAHs生物累积，显示某些PAHs的最高浓度与Adiabo相比。在所有调查物种中，Obutong的海螺、蟹类和沉积物样本中检测到显著更高PAHs浓度，与Nsidung和Adiabo相比，而鱼类PAHs生物累积水平显示相反趋势。例如，来自假定对照站点（Adiabo）的鱼类 exhibit 相对高水平的鱼类（C. nigrodigitatus）肌肉PAHs累积，显示苊烯、总和及LMW PAHs在Adiabo相对较高，与Obutung和Nsidung相比。然而，这些PAHs的较高身体负荷可能反映该物种的杂食性摄食习惯及相关PAHs从较低营养级向C. nigrodigitatus的生物放大。本研究中记录的生物群PAHs浓度显著高，与先前报告浓度相当。

本研究中功能酶水平的 phase I和II响应分析证明显著站点和物种相关差异（在C. nigrodigitatus和T. fuscatus中较高）。特别是对于T. fuscatus，具有最高响应水平，提供了无脊椎动物有趣毒理和生理方面。虽然无脊椎动物通常不易具有外源物质生物转化活性水平，固有 capability 低，即使暴露于污染物，对T. fuscatus的效应表明该物种可能代表生态毒理监测计划的有价值物种。与CYPs一致， phase II酶通常用作外源化合物生物标志物响应，并 exhibit 同工型差异，底物在内源和外源分子间重叠。此处，Ugt和Gst通常遵循与Cyp介导响应（EROD、BROD、MROD和PROD）和氧化应激响应（Gpx和Gr）可比响应模式，如先前在野生鱼类中报告。功能酶响应与本研究中PAHs负荷增加一致，表明所有研究酶在外源物质代谢和排泄中的集体参与。

观察到的底栖生物（海螺、蟹类、虾类）和沉积物中PAHs高出现和浓度表明这些污染物的生物累积、生物可利用性和吸收由沉积物结合生物，并指示微生境在污染物动态和生物累积中的作用。这由现有知识支持，表明PAHs在水生生态系统内转移可能通过生物累积、分布、转化和基质交换发生，其高疏水性亲和力优先 favor 沉积物累积， thus 增加其半衰期。沉积物再分布和再悬浮由物理扰动或底栖-穴居动物生物扰动可能导致其再分布和PAHs从沉积物释放，这可能解释本研究中检测到的沉积物结合底栖生物（海螺和蟹类）中PAHs高累积。此外，Calabar河沉积物和食物网中观察到的站点特异性PAHs流行可能指示这些站点人为活动的直接影响，特别是在假定对照站点Adiabo。例如，沿Calabar河整个长度的高石油活动（Obutong和Nsidung），包括石油化学工业和油罐场的点和扩散源 effluent 排放，以及Calabar河周围高石油勘探和开采活动包括石油非法bunkering和 crude oil 船只破坏，以及 crude oil 运输进入尼日利亚港口的 major 航运路线可能 account for 所有研究站点包括Adiabo观察到的显著高PAHs浓度。总体而言，这再次呼吁质疑环境中是否存在真实参考（对照）研究站点。此外，本研究中记录的PAHs浓度高，可能与尼日利亚水生食物鱼种先前报告水平相当。

鉴于Calabar河的经济和生态重要性及跨水生食物网记录的显著高PAHs浓度，我们的研究强调 alarm 和显著公共健康、食品安全和环境健康关切。如此情况因为，Calabar河被用作当地生活供水源（饮用、烹饪和其他生活活动）。此外，这些水生食物物种是农村人口消耗的主要廉价和可用蛋白质来源。因此，组织PAHs残留可能显著贡献其饮食和人类每日摄入，代表严重公共健康和食品安全风险。由于PAHs的潜在生态效应和毒性包括其致癌、致畸和致突变效应，此处呈现的数据代表持续努力的一部分，旨在生成科学信息，可能帮助地方 sensitization 和政策制定、实施和法规，从发展中国家角度实现可持续食品安全和生态管理。

Conclusions

数据证明沉积物和热带河口食物网中PAHs的站点和物种特异性出现和浓度，以及对定居生物群相应的生物转化和氧化应激效应。我们的结果表明污染站点是决定鱼类、蟹类、虾类和海螺PAHs吸收和生物标志物响应的主要因素，这一观察表明尼日利亚Calabar河生物群样本中站点、PAHs浓度和生物标志物响应间因果关系。