雪旺细胞昼夜节律核心时钟基因表达缺失与恶性NF1相关外周神经鞘瘤中致癌驱动基因节律性表达获得的研究

本综述深入探讨了神经纤维瘤病1型（NF1）相关恶性外周神经鞘瘤（MPNST）中昼夜节律核心时钟基因（如ARNTL, CLOCK）表达节律性的丧失，以及致癌基因（如MYC, VEGFA）节律性表达的新获得。研究揭示了NF1基因突变通过影响MAPK、cAMP-PKA等信号通路导致外周神经胶质细胞（Schwann cell）生物钟紊乱，进而驱动肿瘤发生的新机制。这些发现为理解NF1患者睡眠障碍和肿瘤易感性提供了分子基础，并提示时间疗法（Chronotherapy）可能是潜在的治疗策略。

　　

引言

神经纤维瘤病1型（Neurofibromatosis type 1, NF1）是一种由高度保守的NF1基因（位于17q11.2）致病性变异引起的常染色体显性肿瘤易感综合征。其临床诊断标准包括咖啡牛奶斑、神经纤维瘤、Lisch结节、视路胶质瘤和骨骼病变等。NF1基因编码的神经纤维瘤蛋白（neurofibromin）是一种GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein, GAP），通过负向调控Ras信号通路发挥肿瘤抑制作用。除了肿瘤形成，NF1患者还常伴有睡眠障碍，提示昼夜节律可能参与其中。先前在果蝇和小鼠模型中的研究表明，NF1缺失会通过MAPK通路、cAMP-PKA、钙信号和ALK影响昼夜节律调节，并导致星形胶质细胞节律紊乱。然而，人类雪旺细胞（Schwann cell）是否表现出节律性基因表达仍属未知，而这种节律受损可能参与肿瘤发生。

昼夜节律是大多数生命形式中存在的、以约24小时为周期的生物节律。其核心机制由核心时钟基因（Core clock genes, CCG）构成的转录-翻译反馈环（Transcription-translation feedback loop, TTFL）驱动。正调节因子CLOCK和BMAL1（ARNTL）形成异源二聚体，激活包括Period（PER）和Cryptochrome（CRY）在内的靶基因转录。PER和CRY蛋白复合物则抑制CLOCK:BMAL1的活性，从而形成振荡。核心时钟基因不仅调控内部生物钟，还广泛参与细胞代谢、免疫、DNA修复、细胞周期和染色质重塑等过程。此外，时钟基因的紊乱已被证明能驱动多种肿瘤的发生和发展。

方法

本研究分析了正常人雪旺细胞（HSC）和NF1来源的恶性外周神经鞘瘤（MPNST）细胞系（T265, S462, NSF1）的节律性基因表达。细胞通过血清休克（serum shock）方法进行同步化处理，并在特定时间点定量检测核心时钟及相关基因（如ARNTL, JUN, TGFA, CLOCK, VEGFA, MYC等）的mRNA水平。采用下一代测序（NGS）技术进行转录本分析，并通过Cosinor分析等方法鉴定节律性。同时，还通过定量PCR检测了褪黑素受体（MT1, MT2）的表达，并利用细胞增殖实验测试了褪黑素对MPNST细胞活力的影响。

结果

正常人雪旺细胞的节律性基因表达

研究发现，正常人雪旺细胞表现出核心时钟基因ARNTL/BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2的节律性表达，其周期长度在15.7小时至41.0小时之间。此外，CSNK1E和NR1D1基因也呈现节律性。然而，PER和TIMELESS基因未检测到节律性。这表明人类外周神经胶质细胞拥有内在的昼夜节律振荡。

NF1相关MPNST中节律性基因表达的改变

与正常雪旺细胞相反，所有三种MPNST细胞系均丧失了核心时钟基因的节律性表达。令人惊讶的是，MPNST细胞中出现了致癌基因和生长因子基因从头开始的节律性表达。这些获得节律性的基因包括PER1、TIMELESS、CCND1、MYC、CREM、DBP和VEGFA，其周期大多长于24小时。例如，在S462细胞中，CSNK1E的节律周期从正常细胞的15.7小时延长至41.7小时。MYC和CRY2是MPNST中仅有的两个周期短于24小时的基因。这种核心时钟基因节律性的丧失（去同步化）和致癌基因节律性表达的出现（同步化）是NF1相关MPNST的一个新特征。

褪黑素对MPNST细胞增殖的影响

为了探究能否通过外源信号重塑异常节律，研究测试了褪黑素的作用。结果表明，只有NSF1细胞系对褪黑素处理表现出显著的增殖抑制反应（p ≤ .05），而其他MPNST细胞系和对照成纤维细胞（BRGN）则无此效应。值得注意的是，在正常人雪旺细胞和所有测试的MPNST细胞系中，均未检测到褪黑素受体MT1和MT2的mRNA表达，暗示褪黑素可能通过MT受体非依赖的复杂途径影响外周信号。

讨论

本研究首次证实了正常人雪旺细胞中存在核心时钟基因的节律性表达，填补了人类外周胶质细胞生物钟研究的空白。更重要的是，研究发现NF1相关的MPNST细胞不仅丧失了这种正常的节律性，还获得了致癌驱动基因（如MYC和VEGFA）的节律性表达。

这种节律转换的分子机制可能与NF1基因功能丧失导致的信号通路紊乱有关。神经纤维瘤蛋白通过调控Ras/MAPK和cAMP/PKA通路影响昼夜节律。其功能缺失可能导致这些通路异常，进而破坏核心时钟的TTFL。特别值得注意的是，CLOCK:BMAL1异源二聚体和癌蛋白MYC均能识别并结合E-box序列，共享调控元件。在MPNST中，核心时钟调控的丧失可能为MYC的节律性表达和功能发挥创造了条件，从而促进细胞增殖、细胞周期进程和其他促癌过程。另一方面，MYC的过表达本身也被证明能破坏时钟基因的振荡，形成一个恶性循环。

关于褪黑素反应的差异，可能源于MPNST细胞固有的高度基因组异质性和遗传不稳定性。不同的细胞系积累了不同的次级突变，导致其对调节信号的反应各不相同。未能检测到MT受体表达则表明，褪黑素对人类雪旺细胞及其衍生肿瘤的影响可能不依赖于经典的膜受体通路，而是通过其他尚未阐明的分子机制，例如直接调节蛋白降解或抗氧化作用。

结论

本研究揭示了人类雪旺细胞具有自主的核心时钟基因节律性表达。在NF1相关的MPNST中，这种正常的节律性丧失，取而代之的是致癌基因获得了节律性表达。这种“节律转换”现象为了解NF1相关肿瘤的发病机制提供了新的视角，强调了昼夜节律紊乱在肿瘤发生中的重要作用。研究结果指出，针对生物钟的“时间疗法”（Chronotherapy）可能成为NF1相关MPNST的一种有前景的治疗策略。然而，由于MPNST的遗传异质性和褪黑素信号通路的复杂性，其精确的分子机制和治疗潜力仍需进一步深入探索。