综述：基于热激活延迟荧光的高性能探针增强生物成像

本综述系统探讨了热激活延迟荧光（TADF）材料在生物成像中的前沿应用。文章聚焦TADF探针的光物理机制（如RISC过程、ΔEST调控）、分子设计策略（D-A结构、靶向修饰）及多种封装技术（纳米颗粒、脂质体、聚合物点），重点评述其在细胞器靶向成像（线粒体、溶酶体等）、活细胞动态追踪及模式动物（斑马鱼、小鼠）活体成像中的突破性进展，同时深入剖析当前面临的挑战（如氧淬灭、光稳定性）与未来发展方向。

　　

引言

荧光成像凭借高时空分辨率、高灵敏度及实时监测能力，已成为研究细胞与亚细胞层面分子活动的关键可视化工具。然而，生物组织中复杂组分引发的自发荧光与光散射严重干扰成像信噪比。延迟发光现象——材料在光激发停止后仍能持续发光——可有效抑制短寿命背景荧光干扰。热激活延迟荧光（TADF）材料作为一类特殊材料，具备高量子效率、无重金属、成本低廉等优势，其发光机制涉及通过热活化实现激发态（S₁）与三重态（T₁）间的反向系间窜越（RISC），从而利用三重态激子产生延迟荧光（DF）。自2011年Adachi等人突破性研究以来，多种TADF材料被开发并应用于生物成像领域。

TADF发光机制

TADF材料的发光过程包含瞬态荧光（PF）与延迟荧光（DF）。光激发后，部分单重态激子经系间窜越（ISC）至T₁，再通过RISC返回S₁并辐射衰减发出DF，寿命可达微秒至毫秒级。这一长寿命特性使其适用于时间门控检测，有效区分目标信号与短寿命背景噪声。实现高效TADF需满足两个核心条件：较小的单重态-三重态能隙（ΔE_ST）与高光致发光量子产率（PLQY）。ΔE_ST的减小可通过降低最高占据分子轨道（HOMO）与最低未占分子轨道（LUMO）的重叠实现，例如经典D-A结构分子4CzIPN。此外，非D-A结构分子（如寡聚噻吩）与多重共振TADF（MR-TADF）材料也为分子设计提供了新思路。

TADF探针的设计策略

TADF材料在生物应用中面临水溶性差、氧淬灭严重及光稳定性不足等挑战。目前主要策略包括：

• •

  化学修饰：通过引入亲水链或靶向基团（如线粒体靶向的TPP⁺）增强生物相容性与特异性。例如Al-Cz-AM自组装纳米颗粒（AI-Cz-NP）在细胞中保持约15μs的荧光寿命。

• •

  自组装纳米颗粒：疏水分子通过纳米沉淀法形成亲水纳米颗粒，如4CzIPN有机点（O-dots）用于双光子荧光寿命成像（FLIM）。

• •

  两亲分子封装：采用聚合物、脂质体或蛋白质（如牛血清 albumin BSA）包裹TADF分子，隔离氧与水环境。例如玻璃化有机点（g-Odots）以刚性基质（如mCP）屏蔽氧扩散，PLQY高达94%。

• •

  新型载体系统：包括半导体聚合物点（Pdots）用于NIR-II成像、宿主-客体掺杂纳米颗粒（如BBSF@CBP）用于STED成像，以及碳点（CDs）具备温度响应等功能。

靶向细胞器成像

• •

  细胞膜：CPy-Odots通过DSPE-PEG₂₀₀₀封装实现特异性标记，在斑马鱼血管成像中展现高对比度。

• •

  线粒体：NID-TPP利用线粒体诱导聚集效应（AIDFE）实现时间分辨发光成像（TRLI），在HeLa细胞中呈现显著长寿命信号。

• •

  溶酶体：DC-Lyso探针具备极性敏感的长寿命特性，可监测自噬与衰老过程中的微环境变化；MR-TADF材料PhDPA-DiKTa g-Odots首次实现溶酶体高信噪比成像。

• •

  脂滴：AI-Cz-M纳米探针在氧饱和水溶液中寿命达299μs，实时追踪肿瘤细胞中脂滴形成动态。

• •

  核糖体：AI-Cz-Neo通过新霉素靶向16S rRNA，实现细菌病原体的双模式检测（CLSM与FLIM）。

• •

  内质网：TPNS探针通过硝基还原酶（NTR）触发“开启”式延迟荧光，特异性响应癌症生物标志物。

活细胞追踪

玻璃化有机点（g-Odots）如4CzIPN与HAP-3MeOTPA具备高光稳定性与长滞留时间，在HEK293细胞中可持续追踪至21天（10代细胞）。其刚性基质有效抑制非辐射能量损失与氧淬灭，为长期非侵入性细胞追踪提供理想工具。

活体成像

• •

  小鼠成像：NIR-II发射的Pdots（如BDT-SBOT2）具备深组织穿透能力，实时可视化小鼠血管与骨骼系统，靶向效率与PEG化程度相关。

• •

  斑马鱼成像：双光子FLIM技术结合TADF探针（如TXO NPs）实现深组织高分辨率成像；TPAAQ/CBP/CPP NPs首次实现实时时间门控成像，曝光时间仅0.5秒。

结论与展望

TADF材料凭借高激子利用率、长寿命发射及低生物毒性，在生物成像领域展现巨大潜力。当前挑战集中于氧敏感性、生物相容性、激发波长（需向可见/NIR光发展）及靶向探针多样性（如高尔基体、细胞核探针缺失）。未来需优化分子设计与封装策略，结合三光子成像等先进技术，同时深入开展生物安全性研究（吸收、分布、代谢、毒性），以推动其向临床应用转化。

光毒性权衡

长寿命三重态激子易产生活性氧（ROS），尤其蓝光激发（350-488 nm）风险显著。推荐策略包括：优先选用红/NIR激发、调控ΔE_S1-T1、强化氧屏蔽封装（如mCP基质），并建立标准化评估协议（ROS量化、纵向生物分布研究），确保活体成像安全性。