红树林沉积物可培养细菌基因组学解析及其生态功能与植物促生机制研究

本研究针对红树林生态系统微生物功能认知不足的问题，通过分离培养与基因组学技术，系统解析了沉积物中可培养细菌的多样性及其生态功能。研究人员从三亚河红树林保护区沉积物中成功分离出163株细菌（含51个潜在新种和2个新属），结合公共数据库构建了235株菌株的基因组目录。研究发现这些菌株普遍具有固氮、溶磷、铁载体合成等植物促生功能，关键类群如假单胞菌目和根瘤菌目在碳、氮、硫循环中发挥核心连接作用。该研究为红树林生态修复提供了宝贵的微生物资源和理论依据，发表于《iScience》。

　　

在广阔的海洋与陆地交汇处，红树林生态系统如同一位默默无闻的生态工程师，以其强大的碳汇能力和独特的生态环境养育着无数生物。然而，这片神秘的湿地正面临着日益严重的退化和破坏。尽管红树林被誉为"蓝色碳汇"的重要贡献者，但支撑其健康生长的微生物世界却仍是一片未知的领域。尤其令人困惑的是，红树林沉积物中那些肉眼看不见的细菌究竟如何帮助植物抵抗高盐、缺氧的恶劣环境？它们又如何参与碳、氮、硫等关键元素的循环过程？这些问题一直困扰着科学家们。

传统的分子生物学技术虽然能够揭示微生物群落的构成，却难以真正了解这些微生物的功能特性。就像是一本没有打开的书，我们能看到书的封面，却不知道里面究竟写着什么故事。更遗憾的是，由于红树林环境的特殊性（如高盐度、低pH值、低氧含量等），超过95%的微生物无法通过常规方法培养和研究，这种现象被称为"伟大的平板计数异常"（great plate count anomaly）。这些难以培养的微生物可能掌握着红树林生态系统健康发展的关键密码。

为了解开这些谜团，中国科学家们开展了一项开创性的研究。他们从三亚河红树林自然保护区的沉积物中成功分离出了163株可培养细菌，并通过基因组学方法深入解析了这些微生物的生态功能。这项研究最近发表在了交叉学科期刊《iScience》上，为红树林生态系统的保护和恢复提供了新的科学依据。

研究人员主要采用了细菌分离培养、全基因组测序和生物信息学分析等关键技术方法。样本来源于三亚河红树林保护区四种红树植物（包括外来种无瓣海桑和本地种桐花树、榄李、红海榄）根际沉积物，使用2216海洋培养基(MA)、10%浓度海洋培养基(10% MA)和放线菌分离培养基(AIA)三种培养基进行细菌分离。通过16S rRNA基因测序进行物种鉴定，对75株菌进行全基因组测序，并结合NCBI数据库下载的160个红树林相关细菌基因组，最终构建了235个高质量基因组的分析目录。采用GTDB-Tk进行物种分类注释，使用KEGG、COG、CAZy等数据库进行功能注释，并通过NCycDB、MCycDB、SCycDB等专业数据库分析氮、甲烷和硫循环相关功能基因。

红树林生境中的可培养细菌揭示新多样性

研究人员从红树林沉积物中共获得163个分离株，使用2216海洋培养基(MA)、10%浓度海洋培养基(10% MA)和放线菌分离培养基(AIA)三种培养基。值得注意的是，大多数分离株（72株）是用10% MA培养基获得的，其次是MA（51株）和AIA（40株）。这些分离株基于16S rRNA序列相似性被分类为8个纲的44个属，包括α-变形菌纲(50株)、γ-变形菌纲(66株)、β-变形菌纲(9株)、放线菌纲(29株)、芽孢杆菌纲(4株)、噬纤维菌纲(3株)、黄杆菌纲(1株)和几丁质杆菌纲(1株)。最丰富的细菌分类群属于假单胞菌科(30株)和鞘脂单胞菌科(28株)。

基于98.7%序列相似性 cutoff值，研究人员鉴定出51个潜在新种和2个新属，约占所有细菌分离株的33%。有趣的是，53个潜在新种中有23个是从10% MA培养基中分离得到的。这一发现表明，红树林生态系统蕴藏着高度多样且新颖的细菌资源。

红树林湿地可培养细菌的基因组特征

研究人员获得了75株红树林分离株的全基因组序列，结合从NCBI数据库收集的160个红树林相关分离株基因组，最终构建了包含235个高质量基因组的红树林分离株目录。这些红树林微生物基因组(MMGs)的基因组大小从2.37 Mb到9.72 Mb不等，GC含量在29.76%到74.59%之间变化。此外，44个分离株含有2到11个16S rRNA基因拷贝。

使用基因组分类数据库(GTDB)(版本v207_r2)进行的分类表明，MMGs代表7个门、9个纲、27个目、53个科、106个属和118个种。MMGs数据集以变形菌门(147/235)、放线菌门(43/235)、厚壁菌门(25/235)和拟杆菌门(17/235)为主，而脱硫杆菌门(1/235)、浮霉菌门(1/235)和疣微菌门(1/235)被鉴定为稀有门。更重要的是，8个属和87个种（其中34个来自本研究分离）使用95%的平均核苷酸一致性阈值在GTDB中未被分配到代表性分类，代表着潜在的新谱系。

红树林湿地可培养细菌功能基因组指标的分布

通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)二级水平评估MMGs的代谢途径，发现碳水化合物、氨基酸以及辅因子和维生素的代谢在所有分离株中都很丰富。研究人员注意到某些KEGG途径在不同纲或属间表现出特定的分布模式。细胞运动相关的基因组指标在α-变形菌纲、γ-变形菌纲和芽孢杆菌纲以及假单胞菌属和希瓦氏菌属中丰富。克雷伯菌属和土壤杆菌属显示出与膜运输相关的基因丰度较高。此外，异生素生物降解和代谢的基因组指标主要保存在新鞘氨醇菌属和不动杆菌属中，表明它们具有降解环境污染物的潜力。

通过直系同源群(COG)数据库对MMGs中基因的功能进行注释，发现最多数量的基因组指标与转录(K)、氨基酸运输和代谢(E)以及能量产生和转换(C)相关，特别是在链霉菌属和土壤杆菌属中。MMGs中与细胞壁/膜/包膜生物发生相关的基因相对丰度较高。MMGs偏好碳源(G)，与KEGG结果一致。此外，与铁、硝酸盐和磷酸盐运输相关的无机离子运输和代谢(P)指标在克雷伯菌属中丰富，表明它们具有铁、硝酸盐和磷酸盐运输能力。

研究人员进一步评估了红树林相关细菌利用碳水化合物的潜力。在229个分离株中共鉴定出12,543个潜在的糖苷降解酶(GDEs)，包括50个辅助活性(AA)、756个碳水化合物结合模块(CBM)、799个碳水化合物酯酶(CE)、5,994个糖苷水解酶(GH)、4,700个糖基转移酶(GT)和244个多糖裂解酶(PL)。发现GDE含量在不同门间存在差异，范围从每测序基因组当量(SGE, Mb)0.19到42.92。与变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门相比，放线菌门具有更高的AA和GT的GDE含量。GDEs，特别是CEs、GHs、CBMs和GTs，在链霉菌属、芽孢杆菌属、克雷伯菌属和弧菌属中丰富，而新鞘氨醇菌属和不动杆菌属的AAs、GHs、GTs和CBMs的GDE含量相对较低。

可培养细菌中与碳、氮和硫循环相关的指标基因

为总结红树林相关细菌在生物地球化学循环中的潜在功能作用，研究人员分析了与碳(C)、氮(N)和硫(S)循环相关的指标基因。在甲烷循环方面，研究人员发现mmo和pmo基因好氧甲烷氧化在γ-变形菌纲中广泛存在，而mcr基因厌氧甲烷氧化(AOM)仅限于脱硫杆菌门和浮霉菌门。硝酸盐还原相关基因(nar、nap、nir、nor和nos)在MMGs中广泛分布，其中57个分离株含有完整的反硝化途径。固氮基因(nif)在48个分离株中被检测到，其中15个新鞘氨醇菌属菌株含有完整的nif基因簇。硫酸盐还原相关基因(apr和dsr)在MMGs中广泛分布，其中27个分离株含有完整的异化硫酸盐还原(DSR)途径。

硫氧化和还原基因主要存在于链霉菌属、克雷伯菌属和希瓦氏菌属中。MMGs还含有丰富的连接无机和有机硫转化的基因，包括cysEKMO和metABCXYZ。值得注意的是，用于硫 disproportionation 的指标基因家族phsABC仅在9个红树林分离株中检测到，包括克雷伯菌属、希瓦氏菌属和科萨科尼亚菌属。考虑到参与CH₄、N和S循环的主要分类群，值得注意的是反硝化分类群链霉菌属、假单胞菌属、希瓦氏菌属、克雷伯菌属和土壤杆菌属在红树林生态系统中耦合这三个地球化学循环方面发挥着至关重要的作用。

细菌分离株植物促生特性的指标基因

研究人员观察到20.42%(48/235)的红树林相关分离株拥有固氮的关键指标基因nif，包括新鞘氨醇菌属、克雷伯菌属、希瓦氏菌属、Draconibacterium和红树林杆菌属，表明它们具有成为植物促生细菌(PGPR)的潜力。通过基因组方法进一步研究了红树林分离株的其他植物促生特性，包括吲哚-3-乙酸(IAA)合成、磷酸盐溶解和铁载体产生。

首先，在MMGs中检测到765个与四种主要色氨酸(Trp)依赖性IAA合成途径相关的指标基因，其中14个可能通过色胺途径或吲哚-3-丙酮酸(IPA)途径从Trp从头合成IAA。新鞘氨醇菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属和克雷伯菌属拥有编码转氨酶的关键基因，其功能是将Trp转化为IPA(IPA-ipdC|步骤1)。此外，在不动杆菌属和克雷伯菌属中检测到指标基因ipdC，表明它们能够将IPA脱羧为吲哚-3-乙醛(IAAld)(IPA-ipdC|步骤2)，而在微小杆菌属、土壤杆菌属和克雷伯菌属中检测到参与将IAAld转化为IAA的基因。值得注意的是，两个α-变形菌能够通过植物中存在的YUCCA途径(IPA-YUCCA|步骤3)将IPA转化为IAA。这些发现表明，尽管存在Trp利用基因，绝大多数红树林分离株能够合成IAA。

其次，铁载体合成的指标基因家族ent主要在链霉菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、不动杆菌属和克雷伯菌属中鉴定到，而大多数MMGs含有与铁-铁载体运输(fhu、fep、ycl、fiu)和铁(III)运输(afu)相关的指标基因家族。

第三，与磷饥饿反应调节(pho)、磷酸盐运输(pst)和无机磷溶解(ppa和ppk1)相关的指标基因家族在MMGs中常见，特别是在α-变形菌纲、γ-变形菌纲和拟杆菌纲中，表明它们在磷饥饿条件下动员无机磷的潜力很高。碱性和酸性磷酸酶可以催化磷酸单酯水解（占土壤中有机磷的90%），并经常以其最适pH下的活性为特征。研究人员观察到编码碱性磷酸酶的指标基因家族pho在MMGs中被广泛检测到，这可能与红树林沉积物通常呈酸性有关。此外，能够裂解P-C键的基因家族phn主要在变形菌门中鉴定到，包括土壤杆菌属、假单胞菌属和克雷伯菌属，表明红树林分离株在矿化有机磷酸盐方面具有功能多样性。

研究人员随后调查了235个MMGs中PGP相关基因的交集，旨在鉴定具有多个PGP潜力的分离株。所有MMGs至少含有三个PGP特性。值得注意的是，48个MMGs拥有固氮基因，并且还携带与磷酸盐运输、磷酸盐反应和磷溶解相关的基因，这是由于固氮过程需要细胞ATP。在获得和培养的75个红树林分离株中，22个分离株含有参与固氮的基因，66个分离株拥有与IAA产生相关的指标基因，58个分离株携带与铁载体合成相关的指标基因。

通过整合75个红树林分离株的PGP相关基因分析，推荐显示至少三个或更多PGP特性的菌株，并且仅考虑生长速率相对较快的菌株进行后续选择。从75个菌株中，研究人员从优势属土壤杆菌属、假单胞菌属和克雷伯菌属中选择了7个菌株，以及从稀有属假酸杆菌属、根瘤菌属、异根瘤菌属和科萨科尼亚菌属中选择了4个菌株，通过传统生理功能分析测试PGP特性。结果显示，11个分离株显示固氮的生理功能，随后分别有6个、2个和4个菌株具有IAA产生、铁载体合成和溶解无机磷的生理和基因型潜力。这些结果表明基因型方法在揭示PGP特性方面是有效的。

研究结论与意义

本研究从基因组指标角度系统研究了红树林相关可培养细菌的生态功能。通过163个分离株增加了红树林可培养细菌的数量，其中51个是潜在新种，两个来自新属。此外，通过培养技术和数据库收集，创建了235个红树林相关细菌的综合基因组目录。基因组指标分析表明，这235个分离株几乎都具有支持红树林植物生长的潜在生态功能。关键细菌类群，如假单胞菌目和根瘤菌目，是连接红树林生态系统中碳、氮和硫循环的重要生物地球化学连接器，这表明了红树林湿地的生态健康。

总之，细菌分离结合功能基因组指标分析应该是一种筛选有益细菌类群作为红树林恢复中生物肥料的实用模式。本研究为解析红树林生态系统可培养细菌的功能特性提供了全面的基因组学见解，揭示了这些微生物在植物促生和元素循环中的关键作用，为红树林生态系统的保护和恢复提供了重要的微生物资源和理论指导。

需要注意的是，本研究目前仅限于功能基因组指标水平，只是一个初步的功能研究，需要未来通过整合细菌生理学和代谢学进一步工作。尽管细菌分离和基因组分析表明红树林相关细菌可以通过多种策略（如固氮和溶解磷酸盐）使红树林植物受益，但基因组分析在确认其功能方面仍然有限。关于细菌接种对红树林植物生长影响的进一步研究将是必要的，以揭示可培养细菌与红树林植物之间联系的潜在机制，并最终评估这些红树林相关细菌在红树林湿地中的生态功能。