无细胞重组酶集成布尔输出系统(CRIBOS)：实现体外多重逻辑运算与长期DNA记忆存储的创新平台

本研究针对细胞环境下基因电路构建复杂、资源消耗大等问题，开发了细胞无重组酶集成布尔输出系统(CRIBOS)。研究人员通过优化终止子设计、突变loxP位点等关键策略，成功在无细胞环境中构建了20余种多重输入输出逻辑电路，并结合aTF传感器实现了四个月以上的DNA记忆存储。该技术为低资源环境下的便携式生物计算与环境监测提供了新范式。

　　

在合成生物学快速发展的今天，基因电路已成为医疗诊断、环境监测和生物制造等领域的重要工具。然而，传统基于细胞的基因电路面临细胞存活率限制、生物噪声干扰以及难以检测有毒物质等问题。更令人困扰的是，在资源匮乏的环境中，如何实现长期、稳定的生物信息存储与计算，一直是难以突破的技术瓶颈。

针对这些挑战，波士顿大学的研究团队在《Cell Systems》上发表了创新性研究成果。他们开发了名为CRIBOS（Cell-free recombinase-integrated Boolean output system）的无细胞重组酶集成布尔输出系统，成功将重组酶逻辑电路从细胞环境移植到无细胞体系，并实现了超过20种多重输入输出逻辑门的构建，包括2输入2输出电路和2输入4输出解码器。该系统不仅可与变构转录因子(aTF)传感器结合实现环境多重感知，更突破性地在纸基载体上实现了长达4个月的DNA记忆存储，为低资源环境下的生物计算应用开辟了新途径。

研究团队主要采用以下关键技术：1）使用高纯度PURE（Protein synthesis using recombinant elements）无细胞蛋白合成系统；2）通过终止子优化、loxP位点突变（如lox66/lox72）和插入长度调整等理性设计优化电路性能；3）整合变构转录因子(aTF)传感系统（包括tetR、smtB等）实现化学诱导调控；4）开发冻干纸基反应体系实现长期室温存储；5）采用细菌转化与荧光报告系统（mCherry/GFP/NanoLuc）读取存储信息。

设计表征无细胞环境中的重组酶

研究人员首先对Cre重组酶切除电路进行系统优化。通过使用合成终止子(synTerm)将背景表达降低94%，采用突变lox66/72位点使重组后输出信号恢复39%，并确定启动子与识别位点间10bp的最佳插入距离，最终将切除报告系统的诱导倍数从0.2倍提升至41倍，实现超过200倍的信号优化。该优化策略在另外5种重组酶（Bxb1、PhiC等）中也成功验证，均实现>20倍的输出信号变化。

细胞游离重组酶遗传电路的环境输入

通过将变构转录因子(aTF)与T7RNAP调控系统结合，研究人员实现了重组酶表达的小分子诱导控制。tetR和smtB系统分别成功调控Cre、PhiC和Bxb1重组酶电路，实现对四环素和锌离子的检测。其中锌离子检测限达1.17-4.45μM，四环素检测范围为0.254-59.0μM，ROC曲线分析显示AUC值最高达1.0，证实了传感器的高灵敏度和特异性。

2输入2输出逻辑门

通过精心设计Cre和PhiC重组酶识别位点（lox66/72和PhiC attB/attP）的空间排列，研究团队构建了12种布尔逻辑门。采用重组酶预表达30分钟后再加入报告质粒的分步策略，成功解决了弱活性重组酶（如PhiC）导致的信号泄漏问题，使80%的电路向量夹角小于15°，实现了与预期真值表的高度吻合。

无细胞环境中的2输入4输出BLADE电路

借鉴哺乳细胞BLADE电路设计理念，研究人员通过异源特异性位点（lox66/72和lox2272）的组合，成功构建了2输入4输出解码器电路。经过三次版本迭代优化（最终采用synTerm终止子和优化插入序列），该电路在结合aTF生物传感器后，所有荧光和发光输出的向量夹角均小于25°，实现了对四环素和锌离子的多重环境监测。

基于CRIBOS的无细胞生物记忆存储

最具突破性的是，研究团队将CRIBOS系统与冻干纸基技术结合，创建了便携式生物记忆存储装置。该装置在室温下保存4个月后仍能通过细菌转化准确读取存储信息，且DNA测序验证无突变发生。2输入2输出（NOR、AND门）和BLADE电路均在此平台上稳定运行一个月以上，首次实现了无细胞环境下长期、低维护成本的生物信息存储。

该研究不仅建立了无细胞重组酶电路的关键设计规则，更通过模块化、可扩展的平台设计，为合成生物学提供了新的工具包。CRIBOS系统成功解决了细胞系统在毒性检测、资源竞争和噪声干扰方面的局限，其纸基实现形式尤为适合野外部署和低资源环境应用。未来通过整合更多正交重组酶和传感器，以及与微流控等技术结合，CRIBOS将在环境监测、疾病诊断和生物制造等领域发挥更大价值。这项技术标志着合成生物学从细胞环境向无细胞系统的重大跨越，为真正意义上的便携式生物计算奠定了基础。