微藻-细菌共生系统（MBCS）高效处理猪场厌氧消化废水（ADPE）的构建与机理研究

本研究针对猪场厌氧消化废水（ADPE）有机物浓度高、C-N-P比例失衡、处理难度大的问题，开发了一种基于普通小球藻（C. vulgaris）与原位活性污泥细菌（ASB）的共生系统（MBCS）。通过优化接种比例（1:1）与顺序（先ASB后C. vulgaris），并采用定制化生物膜光生物反应器（MB-BPBR）进行半连续放大试验，实现了对真实ADPE的高效净化，其对TP、TN、NH4+-N和COD的去除率分别达到约60%、70%、98%和66%，且出水COD满足国家排放标准（GB18596–2022）。该研究为高浓度有机废水的资源化处理提供了创新性解决方案。

　　

猪肉是全球范围内生产和消费最广泛的肉类，中国作为最大的生猪生产国，其产量约占世界总产量的一半。规模化养猪产生了大量废弃物，特别是猪粪，若处理不当将引发严重的环境问题。厌氧消化（AD）是目前处理猪粪最常用的方法，它能将废弃物转化为有价值的可再生能源——沼气。然而，该过程同时也会产生大量废水，即厌氧消化猪场废水（ADPE），其通常含有高浓度的难降解有机物和无机盐（氮和磷），且碳氮磷（C-N-P）比例失衡。因此，迫切需要探索有效的营养盐回收技术，以确保废水达标排放并减轻环境影响。

基于微藻的技术因其对毒素的强抵抗力、快速生长、卓越的营养盐去除能力、固碳潜力以及将生物质转化为生物肥料和生物能源的附加价值，已被广泛认为是处理各类废水的重要途径。其中，微藻-细菌共生系统（MBCS）受到了极大关注。大量研究表明，微藻与特定细菌物种之间的互利关系，相较于微藻纯培养，能显著提高生物质生产力和营养盐去除效率。然而，生态位中微藻与细菌的相互作用极为复杂，从互利共生到抑制均有涉及。因此，选择合适的微藻物种和细菌菌株组合，对于建立能够有效处理特定废水类型的稳定MBCS至关重要。尽管MBCS被视为废水处理的有前景的选择，但仍存在显著的知识空白，包括如何构建和维持稳定的MBCS（尤其是在处理真实、未稀释的废水时）、如何经济高效地收获生物质，以及如何阐明微藻与细菌之间潜在的相互作用和通讯机制。

在这项发表于《Algal Research》的研究中，研究人员开发了一种MBCS，用于处理真实、未稀释的ADPE。该系统利用绿色微藻普通小球藻（C. vulgaris）和源自处理猪场废水的厌氧消化池的原位活性污泥细菌（ASB）。研究系统探讨了微藻与细菌的接种比例和接种顺序对MBCS性能的影响。随后，使用定制的、配备固定化C. vulgaris-ASB膜的垂直光生物反应器评估了MBCS在放大规模下的营养盐去除效率，该反应器同时便于生物质回收。此外，还评估了ADPE更新率对光反应器处理性能的影响。最后，研究了微生物群落动态，特别关注了种间相互作用和微生物联盟的时间演变。该研究是探索MBCS在处理高强度ADPE中应用的开拓性且全面的努力。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：1) 微生物驯化与培养：对采购的普通小球藻（C. vulgaris FACHB-2338）采用ADPE进行短期逐步驯化；从养猪场获取ADPE和活性污泥，从中分离培养活性污泥细菌（ASB）。2) 共生系统优化设计：在摇瓶体系中系统测试不同微藻与细菌接种比例（如1:0, 0:1, 1:1, 1:3, 3:1）和接种顺序（如同时接种、先后间隔1天或3天接种）对ADPE净化效果（TP, TN, NH₄⁺-N, COD去除率）和微藻生物量的影响。3) 定制化生物膜光生物反应器（MB-BPBR）构建与运行：设计并制作了以聚乙烯滤布为固定化载体的垂直叠放式光生物反应器，用于半连续操作下的放大试验，并研究不同更新率（0%, 10%, 20%, 30%）下的处理性能。4) 环境指标与微生物分析：采用国标方法监测水质参数（COD, TP, TN, NH₄⁺-N, pH, DO, TIC）；利用扫描电子显微镜（SEM）观察生物膜形态；通过宏基因组测序（基于16S rRNA基因）分析不同处理阶段和条件下的微生物群落结构、多样性和组成（Alpha多样性指数、PCoA、UPGMA聚类、物种注释）。

3.1. 微藻-细菌共生系统的构建、营养盐去除效率及优化

3.1.1. C. vulgaris 与活性污泥细菌接种比例对营养盐去除效率的影响

研究人员测试了不同C. vulgaris与ASB接种比例对ADPE净化效率和微藻生物量生产的影响。在测试的组别中，接种比例为1:1（C:B = 1:1）的处理组表现出最有效的TP、TN和NH₄⁺-N去除效果，最大去除率分别达到88.50%、58.85%和78.65%。该组的C. vulgaris生物量也最高，比纯C. vulgaris组（C:B = 1:0）显著高出90.33%，表明以适当比例引入细菌有益于微藻生长。而过量的细菌接种（C:B = 1:3）则会抑制C. vulgaris生长。通常，TP、TN和NH₄⁺-N的去除率与C. vulgaris生物量成正比。关于COD去除，相等的微藻与细菌接种比例（C:B = 1:1）也表现出最佳性能，去除率达到51.25%。纯细菌组（C:B = 0:1）的COD去除率显著较低（仅25.63%）。这些结果，加上MBCS在脱氮除磷和微藻生物质生产方面的优越性能，清楚地表明C. vulgaris和ASB之间形成了互利共生的关系。这种关系通过直接物质交换、信号转导、代谢互补和协同生物合成等机制实现。特别是碳-氧（C?O）交换机制，其中微藻吸收CO₂并为细菌呼吸提供氧气，而好氧异养细菌释放CO₂并为藻类生长提供无机碳。支持这一点的是，引入微藻后总无机碳（TIC）减少和溶解氧（DO）增加。此外，这种C?O交换动态影响MBCS的pH。与其他组不同，C:B = 1:1组的pH在第6天左右降至约7.0，然后稳定在6.5至7.0之间，这是C. vulgaris和细菌生长的最佳pH范围。因此，C. vulgaris和ASB的相等接种比例导致最高的ADPE净化效率和微藻生物量产量。C. vulgaris和细菌之间的共生关系不是静态的，而是受其接种比例的影响。

3.1.2. C. vulgaris 和活性污泥细菌接种顺序对营养盐去除效率的影响

研究人员研究了C. vulgaris和ASB接种顺序对ADPE净化效率和C. vulgaris生物量的影响。结果表明，不同的接种顺序影响了ADPE的净化效率以及C. vulgaris的生物量积累。总体而言，先接种ASB一天后再接种C. vulgaris（B1C组）表现出最佳性能。虽然其TP去除效率（81.30%）略低于表现最好的C3B组（85.00%），但B1C组实现了TN、NH₄⁺-N和COD的最高去除率，分别达到78.18%、97.00%和64.45%，是对照组CB的1.33、1.23和1.26倍。此外，B1C组获得了第二高的C. vulgaris生物量，仅比C3B组低4.35%。如前所述，MBCS中的好氧异养细菌可以分解有机物，为微藻生长提供无机碳。先接种ASB再接种C. vulgaris，在初始阶段比反向接种顺序导致更高的TIC水平。这种升高的TIC水平促进了C. vulgaris的生长，促进了C. vulgaris和ASB之间的C?O交换，并有助于建立更强大的互利关系。因此，这种协同作用显著增强了ADPE中污染物的去除效率。

可以得出结论，B1C策略——即先接种ASB一天，然后以1:1的接种比例接种C. vulgaris——是构建用于ADPE处理的C. vulgaris-ASB共生系统的最佳选择。本研究中的C. vulgaris-ASB共生系统在污染物去除方面表现出优异的性能，对TP、TN、NH₄⁺-N和COD的去除率分别达到81.30%、78.18%、97.00%和64.45%。这些结果与先前报道的MBCS性能相比具有很强的竞争力。值得注意的是，本研究使用了未稀释的真实ADPE，突出了该系统对复杂废水环境的鲁棒性和适应性。

3.2. C. vulgaris-活性污泥细菌生物膜光生物反应器的构建及ADPE处理性能

为了进一步评估C. vulgaris-ASB共生系统处理ADPE的效率和可扩展性，研究人员设计了一个光生物反应器进行放大测试。考虑到生物质收集的挑战，光生物反应器中采用聚乙烯滤布作为膜组件以促进生物膜形成（基于优化后的共生条件：先接种ASB一天，然后以1:1的接种比例接种C. vulgaris）。此外，还研究了不同ADPE更新率（RT设为10%、20%和30%）对净化效率的影响。更新在阶段III、IV和V开始时进行，即在第10、13和16天。

C. vulgaris-ASB固定化生物膜在运行6天后清晰可见，尽管存在一些界面间隙。随着培养时间延长，生物膜厚度在第19天达到最大值1.5 mm，固定化细胞的干重达到峰值3.27 mg cm^?2。固定化生物膜表现出良好的稳定性，即使在三轮ADPE更新后，在所有RT条件下，固定化生物量始终占总生物量的85%以上。显微镜观察进一步证实了C. vulgaris和ASB之间紧密的物理关联。值得一提的是，光生物反应器占地面积仅为0.025 m²，而有效生物膜面积达到0.125 m²。帘式膜组件有效扩展了垂直空间，同时提高了光能利用效率。

C. vulgaris-ASB生物膜光生物反应器的净化性能如图所示。运行19天后，在10% RT条件下，TP、TN和NH₄⁺-N的总去除率分别达到59.55%、79.00%和99.04%。值得注意的是，RT的变化对TP、TN和NH₄⁺-N的去除率没有显著影响，因为三个RT组之间未观察到统计学上的显著差异（p > 0.05）。相反，RT对COD去除性能有显著影响。最高的COD去除率出现在30% RT组，达到65.51%，比10%和20% RT组分别高出7.85%和7.29%。同样，在日去除率方面，RT对COD的影响也比其他营养指标更明显。在阶段V，30% RT组表现出最高的日COD去除率，为65.67 mg L^?1 day^?1，与10%和20% RT组相比显著提高了6.13倍和4.46倍。这种增强可归因于30% RT组中ADPE的大量补充，这可能既增加了有机底物的供应，又提高了好氧微生物的丰度。由于好氧微生物是有机污染物降解的主要驱动力，其丰度的增加 consequently 提高了COD去除效率。观察到的pH和DO水平的变化也与好氧微生物增殖相关的效应一致。在30% RT组中，第一次ADPE更新（第10天）后pH显著下降，值在大约三天内从9左右降至7左右。这种变化归因于好氧细菌呼吸产生的CO₂增加，同时也伴随着DO水平的降低。值得注意的是，30% RT组的最终出水COD浓度为367.41 mg L^?1，低于中国畜禽养殖业污染物排放标准（GB18596–2022）中规定的直接排放限值（400 mg L^?1）。

3.3. 微藻-细菌共生系统中的细菌群落与组成

为了更深入地了解生物膜光生物反应器系统中微藻和细菌之间的协同相互作用，研究人员进行了宏基因组分析。三种更新率下不同培养阶段的细菌群落组成如表1所示。所有样品的覆盖率值均超过0.99，表明测序深度高，验证了数据在反映微生物多样性方面的准确性和代表性。基于微生物Alpha多样性指数的结果，很明显更新率是塑造群落结构的关键调控参数。随着更新率的增加，细菌群落结构表现出更高的丰富度和多样性。所有多样性指数（包括Shannon、Simpson、Chao1和ACE）在RT30%条件下最高，其次是RT20%，然后是RT10%。这种趋势可能归因于更高更新率下增强的营养可用性。此外，C. vulgaris的引入也对细菌群落结构产生了显著影响。与阶段I（接种ASB）相比，接种C. vulgaris后Shannon、Simpson、Chao1和ACE指数显著增加。这表明C. vulgaris的生长有助于形成更丰富和多样化的细菌群落。藻-菌生物膜的建立培育了更多样化和更具韧性的微生物生态系统，特别是在RT30%条件下，这与增强的污染物去除性能相关，尤其是在COD去除方面。

主坐标分析（PCoA）和非加权组平均法（UPGMA）聚类揭示了相似的微生物群落结构，并进一步表明微藻的引入增加了微生物群落之间的分化。如图所示，阶段I（AS1，纯ASB群落）的微生物群落聚成一个单独的簇，而接种了C. vulgaris的群落则形成一个单独的 major 组。值得注意的是，添加C. vulgaris后，变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度显著增加，而拟杆菌门（Bacteroidota）的相对丰度显著下降。这表明C. vulgaris的存在对微生物群落的组成产生了强烈影响，并且微藻-细菌联盟的结构因更新率的不同而变化。门水平上的进一步分类学分析显示，在不同阶段和RT条件下变化一致。然而，在三个ADPE更新系统中，优势细菌门没有观察到实质性变化。接种C. vulgaris后，三个实验组中优势细菌门发生了显著变化。特别是，变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度从7.74%急剧上升到80%以上。先前的研究表明，变形菌门在促进微藻生长方面起着关键作用，从而提高了C. vulgaris的生物量。相反，最初高达65.65%的拟杆菌门（Bacteroidota）丰度显著下降到20%以下，可能是由于早期阶段NH₄⁺-N的快速去除。因为拟杆菌门通常被认为具有很强的氨降解能力，而NH₄⁺-N可用性的减少可能限制了它们的增殖。第一次ADPE更新后，三个实验组中变形菌门的丰度下降到约40%，而蓝藻门（Cyanobacteria）的丰度显著增加，从不到1%上升到 around 30%。这种转变可能是由于拟杆菌门（已知能促进蓝藻细胞裂解）受到抑制，以及NH₄⁺-N抑制的缓解。高浓度的NH₄⁺-N已知会抑制蓝藻生长。因此，更新后NH₄⁺-N的下降使得蓝藻得以增殖。在后期阶段，RT30%组中变形菌门的丰度在第二次ADPE更新后反弹至71.03%，并在第三次更新后达到63.32%，保持主导地位。同时，在RT10%组中，放线菌门（Actinobacteria）的丰度从1.55%显著增加至45.62%。这可能归因于许多放线菌的自养能力，使它们能够在废水营养水平下降的后期处理阶段茁壮成长。此外，值得注意的是，绿弯菌门（Chloroflexi）的丰度随着更新率的增加而增加，在30% RT系统中达到0.42%。先前的研究表明，绿弯菌可以降解和利用生物质 decay 过程中释放的大分子，同时通过丝状生物质网络有助于形成稳定的絮体结构。

属水平上的相对细菌分类群丰度说明了不同培养阶段和不同更新率下的情况。值得注意的是，在没有C. vulgaris的AS1系统中，假单胞菌属（Pseudomonas）仅占0.67%，而在补充C. vulgaris后其丰度显著增加至46.29%（p < 0.05）。在30% RT组中，硫杆菌属（Thiobacillus）的相对丰度达到13.16%，是10% RT组的24.23倍，是20% RT组的16.87倍。假单胞菌属和硫杆菌都属于变形菌门。研究表明，假单胞菌可以产生信号分子刺激微藻生长，而硫杆菌不仅参与难降解有机化合物的生物降解，还在反硝化过程中起着至关重要的作用。这些微生物动态与RT30%组中TN、NH₄⁺-N和COD的高日去除率相一致，进一步强调了这些细菌在废水处理中的关键作用。

本研究得出结论，优化的条件——即在以1:1比例接种原位活性污泥细菌一天后添加C. vulgaris——对真实、未稀释的ADPE产生了最佳处理性能。在放大试验中，定制设计的微藻-细菌生物膜光生物反应器在半连续操作下表现出良好的性能，保持了约60%的TP、70%的TN、98%的NH₄⁺-N和66%的COD去除效率。虽然ADPE更新率对TP、TN或NH₄⁺-N的去除没有显著影响，但COD去除在更高更新率下显著增强，在30%更新条件下观察到最高效率。宏基因组分析表明，接种C. vulgaris有效增加了细菌群落的丰富度和均匀度，有助于微藻-细菌联盟系统相比纯培养物具有更优越的处理性能。此外，更新率也影响了细菌群落组成。在30%更新条件下，变形菌门（Proteobacteria）丰度的增加可能促进了系统稳定性并增强了COD去除。总体而言，该研究为设计用于ADPE处理和其他高强度废水的可扩展光生物反应器提供了实用参考。此外，研究结果代表了一种可持续的生物修复策略，通过将废水处理与微藻生产和作物种植相结合，实现了处理后的出水作为农业肥料再利用，以及收获的藻类生物质用于生物能源、生物肥料或其他高价值生物产品的增值。尽管放大试验的结果令人鼓舞，但目前的反应器处理能力仍然相对有限，因此未来的工作应侧重于中试规模的研究。