用于现场超灵敏同步检测唾液皮质醇与褪黑素的双通道自放大侧流免疫层析技术

本刊推荐：本研究创新性开发出双通道自放大侧流免疫分析技术（2ch-saLFI），首次实现单次进样同步检测唾液皮质醇（cortisol）与褪黑素（melatonin）。该技术通过金纳米颗粒增强（gold enhancement）信号放大机制，检测灵敏度达皮质醇5.39 pg mL?1、褪黑素0.476 pg mL?1，临床验证与ELISA法高度吻合（R2>0.9）。该平台为昼夜节律评估提供了革命性的床旁检测（POCT）解决方案。

　　

Chemicals and reagents

牛血清白蛋白（BSA）、皮质醇-BSA结合物以及表面活性剂10G（S10G）购自Fitzgerald Industries International公司（美国）。抗皮质醇抗体（XM201）和抗褪黑素抗体（EPPTX-R10-35-7）采购于Abcam公司（英国）。褪黑素-BSA结合物由MyBioSource公司（美国）提供。硝酸纤维素（NC）膜（ImmunoporeRP）购自Whatman公司（美国），而用于采集唾液样本的Salivette?装置则来自Sarstedt公司（德国）。金纳米颗粒（AuNPs）以及用于金增强过程的金酸盐和羟胺试剂购自Sigma-Aldrich公司（美国）。所有其他化学试剂均为分析纯级别。

2ch-saLFI

如图1A所示，2ch-saLFI通过将两个独立的saLFI试纸条与一个双通道样本垫组装而成。皮质醇和褪黑素saLFI均包含吸收垫、NC膜、结合垫、宽样本垫以及自放大复合物。如前所述，NC膜上设有检测线和删除线，其功能等同于传统竞争性LFI系统中的控制线和测试线。每个saLFI试纸条的删除线上掺杂有相应的分析物-蛋白质结合物（皮质醇-BSA或褪黑素-BSA），而检测线上则固定有对应的捕获抗体（抗皮质醇或抗褪黑素抗体）。自放大复合物由金纳米颗粒（AuNPs）与相应的分析物分子（皮质醇或褪黑素）结合而成，作为竞争性免疫分析的信号探针。样本垫经过特殊处理，含有金增强反应所需试剂（金酸盐和还原剂）。当样本溶液被注入时，它会水合自放大复合物，启动竞争免疫反应。随后，金增强试剂通过毛细作用流动，在AuNPs上还原金离子，从而显著放大颜色信号。

Conclusion

本研究成功开发并验证了一种新型双通道自放大侧流免疫分析技术（2ch-saLFI），它是首个能够通过现场单步操作同步检测唾液皮质醇和褪黑素的LFI传感器。先前开发的用于唾液皮质醇检测的自放大侧流免疫分析（saLFI）平台被成功应用于唾液褪黑素的检测。随后，通过将两种saLFI与一个创新的双通道样本垫集成，构建了2ch-saLFI。该设计确保了样本溶液均匀分配到两个试纸条和两个自放大复合物中，从而实现了从单次样本注入中同步检测两种激素。2ch-saLFI对皮质醇和褪黑素的检测限分别达到5.39 pg mL^?1和0.476 pg mL^?1，显著低于生理浓度水平，并且与标准ELISA方法表现出高度一致性。因此，2ch-saLFI作为一种强大且用户友好的诊断工具，为现场、实时评估昼夜节律紊乱、压力水平和睡眠障碍提供了新的可能性。