利用CRISPR/Cas9技术敲除vasa基因培育不育型转基因荧光海水青鳉以规避生态风险

本文针对转基因观赏鱼逃逸可能引发的生态风险问题，推荐研究人员通过Tol2转座子系统构建表达mCherry的转基因海水青鳉品系，并利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑生殖细胞特异性基因vasa（DDX4）。研究发现纯合vasa-/-突变体表现为不育雄性，其睾丸缺乏生殖细胞但保留正常求偶行为。该研究为转基因观赏鱼商业化提供了安全可控的育种策略，对水生生物安全管控具有重要参考价值。

　　

随着绿色荧光蛋白（GFP）技术的突破，转基因荧光观赏鱼已成为水族市场的新宠。自2003年美国FDA批准首例转基因荧光斑马鱼上市以来，这类通过基因工程手段携带荧光蛋白的观赏鱼类因其独特的观赏性受到广泛关注。然而，其潜在生态风险始终是悬而未解的达摩克利斯之剑——一旦逃逸至自然水域，可能通过竞争资源或与野生种群杂交破坏本地生态系统平衡。尽管国际鱼类入侵性筛查工具（FISK）评估显示转基因荧光鱼入侵风险较低，但巴西和美国均已发现逃逸的转基因斑马鱼建立野外种群的现象，这为全球生态安全敲响了警钟。

传统不育化技术如种间杂交或三倍体诱导存在缺陷，部分个体仍可能产生功能性配子。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术的成熟为精准培育不育品系提供了新路径。本研究以海水青鳉（Oryzias melastigma）为模型，通过多维度基因操作策略，成功创建了兼具观赏价值与生物安全性的新型荧光鱼品系。

研究团队首先利用Tol2转座子系统构建转基因品系Tg(mylz2:mCherry)，采用斑马鱼肌球蛋白轻链2（mylz2）基因启动子驱动mCherry红色荧光蛋白在肌肉组织特异性表达。成年转基因鱼在自然光下即可呈现肉眼可见的紫红色荧光。为彻底解决生态隐患，研究人员进一步针对生殖细胞特异性标记基因vasa（即DDX4）设计CRISPR/Cas9编辑策略：通过注射三种靶向不同外显子的gRNA（gRNA-1/2/3）与Cas9蛋白复合体至单细胞期胚胎，成功诱导DNA片段缺失突变。实验证明多gRNA共注射显著提高突变效率（P<0.01），并实现F0代双等位基因大片段敲除（LKO）。通过传代培养获得纯合突变体vasa^-/-，其Vasa蛋白 motif IV区缺失单个缬氨酸（Valine）。

关键技术方法包括：1）采用Tol2转座子系统构建肌肉特异性表达mCherry的转基因品系；2）设计多靶点gRNA并通过体外转录合成；3）通过限制性内切酶消化法和Sanger测序验证突变类型；4）建立突变体品系并进行生殖能力测试；5）组织学HE染色与基因表达（RT-PCR）分析生殖腺发育状态；6）使用海洋青鳉模型开展交配实验评估生育力。

研究结果揭示：

3.1. 转基因海水青鳉稳定表达鲜艳红色荧光

F1代转基因胚胎在8日龄（8 dpf）时全体节均呈现mCherry荧光，成年鱼肌肉组织在自然光下显现紫色荧光，证实mylz2启动子跨物种应用的保守性。

3.2. 单/多gRNA介导的vasa基因敲除

多gRNA共注射组突变效率（85.7%）显著高于单gRNA组（最高57.1%），并成功获得缺失1,283 bp大片段突变体。测序证实突变类型包含框内缺失与移码突变。

3.3. vasa敲除品系建立

F0代嵌合体与野生型交配后，F1代仅保留3-bp/18-bp框内缺失突变。系统进化分析显示缺失的缬氨酸位点在脊椎动物Vasa蛋白中高度保守。

3.4. vasa纯合突变体发育为不育雄性

F2代基因型比例符合孟德尔遗传规律（21+/+ : 40+/- : 23-/-）。所有vasa^-/-个体均表现为雄性第二性征（锯齿状背鳍和尖形臀鳍），但睾丸呈线状且显著小于野生型（P<0.0001）。组织学显示突变体睾丸管腔内无生殖细胞，仅存体细胞。RT-PCR检测发现vasa^-/-生殖腺中Leydig细胞标志物cyp11c1表达正常，但Sertoli细胞标志物amh及生殖细胞标记物vasa、dazl完全缺失。交配实验证实突变体雄鱼能正常诱导雌鱼产卵，但卵细胞均未受精。

讨论部分指出：本研究首次在海水青鳉中实现vasa基因精准编辑，证实 motif IV区单个缬氨酸缺失即可导致Vasa功能完全丧失。与斑马鱼、青鳉等模式生物一致，vasa缺失突变体均发育为不育雄性，表明生殖细胞的存在是卵巢分化的必要条件，这区别于鲑鱼、金鱼等生殖细胞非依赖性性别分化模式。多gRNA策略显著提高F0代双等位基因突变效率，为长生命周期水产动物的基因功能研究提供新方案。

该研究的双重意义在于：一方面通过CRISPR/Cas9技术创制安全可控的转基因观赏鱼，为商业化应用提供生物安全范本；另一方面揭示Vasa蛋白功能结构域的保守性，深化对鱼类生殖细胞调控机制的理解。研究者强调，即使是不育品系上市仍需遵循当地法规监管，且需持续开展生态风险评估。本文发表于《Aquaculture and Fisheries》，为水产育种领域的生物安全管控提供了重要理论与实践依据。