CD47-VE-cadherin-Mfp5融合蛋白涂层协同促进血管支架内皮化并抑制炎症反应

本研究针对血管支架植入后再内皮化延迟和炎症反应等临床难题，开发了一种新型CD47-VE-cadherin-Mfp5（CD47-VE-M）融合蛋白涂层。该涂层整合了VE-cadherin（EC1-2结构域）增强内皮黏附、CD47抑制巨噬细胞吞噬信号和Mfp5强化基底黏附三大功能域。实验表明，该涂层显著促进内皮细胞黏附（较BMS提高3.4倍）、迁移（24小时加速62%）和增殖（提高2.3倍），同时降低巨噬细胞吞噬59%。体内实验证实其可加速内皮化、减少64.4%的新内膜增生和狭窄，并降低64.74%的M1促炎巨噬细胞浸润。该策略突破了现有药物洗脱支架（DES）的局限性，为血管植入物提供了兼具促内皮修复和抗炎功能的创新解决方案。

　　

心血管疾病是全球范围内的主要健康威胁，血管支架介入术已成为治疗冠状动脉疾病的重要手段。然而，支架植入后的再狭窄（restenosis）和晚期支架内血栓形成（late stent thrombosis）仍是临床面临的严峻挑战。虽然药物洗脱支架（DES）能有效抑制平滑肌细胞增生，但其携带的抗增殖药物（如西罗莫司）同时会延缓内皮细胞修复，加之聚合物涂层可能引发的慢性炎症反应，导致血管愈合延迟和血栓风险增加。因此，开发能够同时促进快速内皮化并抑制病理性炎症反应的生物活性涂层，成为血管支架领域的研究热点。

在这项发表于《Bioactive Materials》的研究中，研究人员创新性地构建了一种三重功能融合蛋白涂层——CD47-VE-cadherin-Mfp5（CD47-VE-M）。该设计巧妙整合了三个关键功能域：源自血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）的EC1-2结构域用于增强内皮细胞特异性黏附和连接；CD47胞外域作为"别吃我"信号抑制巨噬细胞吞噬活性；以及源自贻贝黏附蛋白（Mfp5）的强效黏附域确保涂层在生理环境中的稳定性。这种多功能协同设计旨在同时解决内皮修复不足和过度炎症反应两大核心问题。

研究团队采用分子克隆技术构建原核表达载体，通过大肠杆菌表达系统成功获得可溶性融合蛋白。采用原子力显微镜（AFM）和扫描电镜（SEM）表征涂层表面特性，通过静态水接触角测量评估亲疏水性。体外实验采用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）和RAW264.7巨噬细胞系评估生物相容性，包括细胞黏附、增殖、迁移和吞噬实验。体内研究使用SD大鼠腹主动脉支架植入模型，通过光学相干断层扫描（OCT）、扫描电镜和组织学分析（包括VVG染色和免疫荧光）评估内皮化程度、新生内膜增生和炎症反应。统计分析采用SPSS软件进行。

3.1. 协同CD47-VE-M融合蛋白原核载体的构建

研究人员成功构建了pCold TF-CD47-VE-M原核表达载体，通过SDS-PAGE和Western blot验证了蛋白表达和纯化。从五种连接子设计中筛选出活性最佳的linker-1构型，生物信息学分析显示该融合蛋白具有亲水性，二级结构包含α-螺旋（18.06%）、延伸链（30.32%）、β-转角（14.12%）和无规卷曲（37.50%）。

3.2. 协同CD47-VE-M融合蛋白涂层的表征

AFM和SEM分析显示蛋白质涂层显著改变了316L不锈钢表面形态，CD47-VE-M涂层的水接触角为43.9±3.3°，表现出最佳亲水性。涂层表面粗糙度均低于50nm的蛋白质吸附阈值，符合血液相容性标准。溶血率测试表明所有涂层均低于5%的安全标准（CD47-VE-M为1.227±0.03%）。血小板黏附实验显示CD47-VE-M涂层能最有效抑制血小板活化和黏附。机械测试证实涂层在支架扩张后仍保持完整性和均匀性。

3.3. 协同CD47-VE-M融合蛋白涂层的体外评估

细胞实验表明，CD47-VE-M涂层显著促进内皮细胞黏附（较BMS提高3.4倍）和增殖（提高2.3倍）。细胞骨架染色显示涂层上的内皮细胞具有更完整的膜周骨架分布，增强了细胞间连接。划痕实验证明涂层加速内皮细胞迁移（24小时加速62%）。共培养实验显示CD47-VE-M涂层对内皮细胞的选择性黏附优于平滑肌细胞，EC/SMC黏附比提高两倍以上。

3.4. 协同CD47-VE-M融合蛋白增强细胞紧密连接和eNOS水平

免疫荧光显示CD47-VE-M涂层上的内皮细胞呈现连续均匀的VE-cadherin连接，紧密连接蛋白ZO-1表达显著增加。ELISA检测发现涂层显著提升内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达和一氧化氮（NO）产生，表明内皮功能改善。

3.5. 协同CD47-VE-M融合蛋白涂层的体内评估

扫描电镜显示CD47-VE-M涂层支架在1个月时即实现完全新生内膜覆盖，而DES组仍有少量血小板黏附。OCT和组织学分析表明，CD47-VE-M涂层显著抑制新生内膜增生，6个月时狭窄率降低64.4%。免疫荧光显示涂层组内皮覆盖完整，平滑肌细胞排列有序。

3.6. CD47-VE-M融合蛋白涂层对炎症细胞的调控

体外吞噬实验表明CD47-VE-M涂层降低巨噬细胞吞噬活性59%，CD47抗体阻断可逆转此效应。体内免疫荧光显示涂层显著减少巨噬细胞（CD68+细胞）浸润59%和M1促炎巨噬细胞（CD68+CD86+细胞）65%。器官组织学和血液学分析证实涂层具有良好的生物安全性。

该研究开发的CD47-VE-M融合蛋白涂层代表了一种创新的血管支架功能化策略。通过协同整合VE-cadherin介导的内皮特异性黏附、CD47提供的免疫调节信号和Mfp5确保的涂层稳定性，成功实现了促进快速内皮化与抑制病理性炎症的双重目标。研究结果表明，该涂层不仅能显著增强内皮细胞功能（包括黏附、迁移、增殖和屏障功能），还能有效调控免疫反应，减少巨噬细胞浸润和极化。

与传统药物洗脱支架相比，这种蛋白涂层策略避免了抗增殖药物对内皮修复的抑制作用，同时解决了聚合物涂层可能引发的慢性炎症问题。其多靶点作用机制——通过VE-cadherin增强内皮连接和屏障功能，通过CD47-SIRPα信号轴抑制巨噬细胞吞噬活性，以及通过Mfp5确保涂层稳定性——为血管植入物提供了更加全面的生物相容性解决方案。

该研究的重要意义在于：首先，它提供了一种无需药物的功能性涂层方案，避免了药物洗脱支架的局限性；其次，它首次将VE-cadherin的内皮特异性黏附功能与CD47的免疫调节功能相结合，实现了血管修复过程中不同生物学过程的协同调控；最后，该策略具有良好的临床转化前景，为下一代血管支架的设计提供了新思路。

未来研究可进一步优化涂层稳定性，在糖尿病和动脉粥样硬化等疾病模型中验证其效果，并探索其在其他血液接触器械中的应用潜力。这种协同多功能涂层策略不仅对血管支架领域有重要价值，也为其他植入式医疗器械的表面功能化设计提供了借鉴。