苜蓿根瘤菌YbgC样硫酯酶SMc03960鉴定及其在信息化学物质2-十三烷酮合成中的作用机制研究

本刊推荐：为解析苜蓿根瘤菌挥发性甲基酮类化合物生物合成机制，研究人员通过蛋白质组学筛选、异源表达和体外酶活实验，发现YbgC样硫酯酶SMc03960可特异性水解酰基-ACP/CoA底物生成2-十三烷酮(2-TDC)。该研究首次证实细菌YbgC家族蛋白兼具酰基-ACP硫酯酶活性和甲基酮合成功能，为微生物源信息化学物质的生物合成提供了新见解。

　　

在微生物与植物的共生关系中，化学信号分子起着至关重要的调控作用。苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)作为豆科植物苜蓿的固氮共生菌，其与宿主植物的成功互作依赖于精细的分子对话。近年来研究发现，当苜蓿根瘤菌的fadD基因（编码长链脂肪酰基辅酶A合成酶）失活时，菌株会过量产生多种挥发性甲基酮类化合物(methylketones, MKs)，其中2-十三烷酮(2-tridecanone, 2-TDC)被证实是一种影响细菌特性和植物-细菌互作的信息化学物质(infochemical)。然而，关于细菌中甲基酮生物合成的基因和酶学机制至今仍知之甚少。

在野生番茄中，甲基酮合成需要脂肪酸生物合成中间体的参与以及甲基酮合酶2(methylketone synthase 2, MKS2)的活性。MKS2是一种属于hotdog-fold家族的硫酯酶。那么，在苜蓿根瘤菌中，是否存在类似的酶学机制？是否也有特定的硫酯酶负责2-TDC的合成？这些问题成为本研究关注的焦点。

为了回答这些问题，研究人员在《Biochemical Journal》上发表了最新研究成果。他们通过生物信息学分析、异源表达、蛋白质纯化、酶动力学测定以及体内外功能验证等多种技术手段，首次在苜蓿根瘤菌中鉴定出一个YbgC样硫酯酶SMc03960，并系统阐明了其在甲基酮合成中的功能和作用机制。

本研究主要采用了以下关键技术方法：通过BLASTP同源比对从苜蓿根瘤菌蛋白质组中筛选MKS2同源蛋白；利用pET系统在大肠杆菌中进行异源表达和功能验证；通过镍柱亲和层析纯化His标签融合蛋白；使用DTNB比色法和变性凝胶电泳分别测定酰基-CoA和酰基-AcpP底物的酶动力学参数；采用固相微萃取-气相色谱/质谱联用技术(SPME-GC/MS)检测挥发性甲基酮；通过放射性薄层色谱(radio-TLC)分析酶促反应产物。

SMc03960，一个与番茄MKS2同源的苜蓿根瘤菌YbgC样蛋白

研究人员首先以番茄MKS2蛋白序列（不含叶绿体转运肽）为查询序列，对苜蓿根瘤菌蛋白质组数据库进行BLASTP分析，发现SMc03960与番茄MKS2具有25%的序列一致性和80%的覆盖度。序列比对和二级结构预测表明，SMc03960与MKS2具有相似的结构特征。SMc03960被注释为一个保守的假设蛋白，长度为151个氨基酸，与来自不同细菌的Tol-Pal系统相关酰基-CoA硫酯酶（称为YbgC）具有同源性。值得注意的是，虽然在大肠杆菌中ybgC通常是tol-pal基因簇的第一个基因，但在苜蓿根瘤菌中，smc03960下游并以相反方向编码一个非同源末端连接 LigD蛋白(LigD4)的基因，这中断了tol-pal基因簇的结构。SMc03960与大肠杆菌YbgC具有39%的同一性，并共享[DTD-X(2)-GVV-X-H-X(2)-Y] consensus序列，该序列定义了YbgC蛋白的核心活性位点。这些发现从氨基酸序列相似性和基因组背景两方面证实，MKS2同源物SMc03960是苜蓿根瘤菌的YbgC样蛋白。

在大肠杆菌中表达smc03960导致甲基酮和游离脂肪酸的释放

为了确定SMc03960的生化活性，研究人员将smc03960 ORF在大肠杆菌中使用pET表达系统进行表达。通过薄层色谱(TLC)分析发现，与含有空载体pET17b的大肠杆菌菌株相比，表达smc03960的培养物上清液中明显增加了四个斑点，经鉴定分别为甲基酮、游离脂肪酸和3-羟基脂肪酸，另一个斑点的身份尚不清楚。在SMc03960中，天冬氨酸(D)27很可能是一个必需的活性位点残基，因为将SMc03960-D27A突变后，上清液中的脂质谱与空载体对照没有显著差异，表明D27残基对于化合物的释放是必需的。

通过气相色谱/质谱(GC/MS)进一步分析发现，表达smc03960显著增加了2-TDC和2-十五烷酮(2-PDC)的产量（分别增加了约55倍和36倍），并且在表达smc03960的菌株脂质提取物中鉴定到了在对照培养物中不存在的2-十一烷酮(2-UDC)。这些结果表明SMc03960参与甲基酮的生产，且2-TDC是过表达菌株中主要的甲基酮，表明3-氧代-肉豆蔻酰-ACP和/或3-氧代-肉豆蔻酰-CoA可能是该硫酯酶的首选底物。

分析还发现，表达smc03960导致上清液中某些游离脂肪酸的量增加，其中增加最多的是3-羟基棕榈酸(3OH-C16:0)，其次是3-羟基肉豆蔻酸(3OH-C14:0)（分别增加了13.5倍和10.5倍）。此外，表达smc03960导致不饱和脂肪酸C12:1和C14:1显著增加（分别增加了4.6倍和3.7倍），尤其是C16:1和C18:1（分别增加了8.6倍和7.3倍）。这些结果表明SMc03960硫酯酶的底物特异性在链长、氧化状态和饱和度水平方面都很广泛。

His-SMc03960的体外底物特异性

为了进一步确定SMc03960的底物特异性，研究人员在大肠杆菌中过量表达带有N端His标签的SMc03960，并纯化得到均一性蛋白。使用各种酰基-CoA以及来源于苜蓿根瘤菌纯化AcpP的酰基-AcpP作为底物进行体外反应。

His-SMc03960对多种酰基-CoA和酰基-AcpP都显示出活性。在测试的酰基-CoA底物中，检测到对短链和中链酰基-CoA底物（丙酰-CoA、辛酰-CoA和癸酰-CoA）只有较小的活性。 among the tested acyl-CoA substrates, the highest catalytic efficiency was detected for myristoyl-CoA, while efficiency was reduced to about half for lauroyl-CoA and palmitoyl-CoA.

在测试的饱和酰基-AcpP中，对C14链长的肉豆蔻酰-AcpP也发现了最高的硫酯酶活性，并且对C12:0、C16:0和C18:0衍生的酰基-AcpP也检测到显著活性。当C16或C18的单不饱和脂肪酸连接到AcpP上时，His-SMc03960的催化效率与饱和酰基-AcpP对应物相似。然而，对于十四碳烯酰-AcpP，催化效率只有肉豆蔻酰-AcpP的一半。在体外实验中，His-SMc03960对3-羟基肉豆蔻酰-AcpP显示出最高的底物偏好，而对携带C12或C16的3-羟基脂肪酸的AcpP的催化效率只有对3-羟基肉豆蔻酰-AcpP的四分之一。值得注意的是，对3-羟基肉豆蔻酰-AcpP的相对高特异性主要是由于较高的转换数(k_cat)。

通过His-SMc03960体外形成2-TDC

研究发现2-TDC是在大肠杆菌中表达smc03960后最丰富的甲基酮。番茄硫酯酶MKS2使用脂肪酸生物合成中间体3-氧代-肉豆蔻酰-ACP形成3-氧代-肉豆蔻酸，经过脱羧后生成2-TDC。研究人员测试了纯化的His-SMc03960是否能够像MKS2一样，使用3-氧代-肉豆蔻酰-AcpP作为底物在体外生成2-TDC。

为了获得3-氧代-肉豆蔻酰-AcpP，研究人员进行了一系列反应：首先使用大肠杆菌的Aas和苜蓿根瘤菌的His-FabD分别获得月桂酰-AcpP和丙二酰-AcpP；然后将月桂酰-AcpP和丙二酰-AcpP与苜蓿根瘤菌的His-FabB一起孵育，获得可能是3-氧代-肉豆蔻酰-AcpP的新条带。由于3-氧代-肉豆蔻酰-AcpP的不稳定性质，它没有被进一步纯化，反应混合物被用于体外硫酯酶活性测定。

将含有[2-¹⁴C]3-氧代-肉豆蔻酰-AcpP的样品与His-SMc03960孵育30分钟后，特异性导致了被鉴定为3-氧代-肉豆蔻酰-AcpP的条带消失，而在相同条件下仅用缓冲液处理则没有导致条带消失。月桂酰-AcpP的量在这两个反应中没有受到显著影响，表明His-SMc03960优先水解3-氧代-肉豆蔻酰-AcpP而不是月桂酰-AcpP。

为了通过TLC检测2-TDC的可能形成，研究人员使用放射性标记的[2-¹⁴C]丙二酰-CoA在FabD反应中形成[2-¹⁴C]丙二酰-AcpP。使用这种放射性标记的前体和月桂酰-AcpP，在FabB催化的反应中产生[2-¹⁴C]3-氧代-肉豆蔻酰-AcpP，经His-SMc03960水解后产生[2-¹⁴C]3-氧代-肉豆蔻酸。不稳定的化合物[2-¹⁴C]3-氧代-肉豆蔻酸自发脱羧产生[1-¹⁴C]2-TDC。直接提取经过His-SMc03960处理的含有[2-¹⁴C]3-氧代-肉豆蔻酰-AcpP的反应的脂质化合物后，观察到一个主要斑点，可能对应于3-氧代-肉豆蔻酸，而仅在用缓冲液孵育的反应中观察到微弱的条带。此外，只有在用His-SMc03960处理的样品中观察到一个放射性标记条带，其迁移与2-TDC标准品相同。这些数据表明His-SMc03960能够将3-氧代-肉豆蔻酰-AcpP水解为3-氧代-肉豆蔻酸，后者可以自发脱羧生成2-TDC，从而证实了YbgC样蛋白SMc03960在2-TDC形成中的作用。

在野生型和fadD突变体苜蓿根瘤菌菌株中过表达smc03960增加了挥发性2-TDC的产量

为了测试SMc03960在苜蓿根瘤菌中是否参与甲基酮的生成，研究人员获得了来源于野生型和fadD突变体遗传背景的smc03960突变体和smc03960过表达菌株。

通过顶空固相微萃取-气相色谱/质谱(SPME-GC/MS)分析野生型和fadD突变体菌株在MM(1%琼脂)上生长48小时后释放的挥发物。结果显示，野生型菌株GR4产生甲基酮2-TDC、2-PDC和2-十七烷酮(2-HpDC)，而fadD功能缺失的菌株GFDC导致这些挥发物的产量增加（2-TDC、2-PDC和2-HpDC分别增加了约4倍、5倍和11倍）。

在野生型背景中删除smc03960（菌株GΔ3960）对甲基酮生产没有造成任何显著影响。同样，在fadD突变背景中删除smc03960（菌株GFDΔ3960）也没有影响挥发性甲基酮的释放。相比之下，由pIML55质粒提供的smc03960过表达使野生型和fadD突变体菌株释放的2-TDC水平增加了约3.7倍。smc03960过表达似乎也诱导了野生型和fadD突变体产生的另外两种甲基酮（2-PDC和2-HpDC）水平的小幅增加，但这些情况下的差异没有统计学意义。

这些结果表明SMc03960的硫酯酶活性可以促进苜蓿根瘤菌中2-TDC的生产。而且，在过表达smc03960的fadD突变体中观察到的2-TDC释放增加表明SMc03960可以使用3-氧代-肉豆蔻酰-AcpP作为底物，如使用纯化的His-SMc03960在体外所示。然而，删除smc03960并不消除甲基酮生产的事实表明，还有其他尚未知的酶活性参与苜蓿根瘤菌中的甲基酮合成。

研究结论与意义

本研究揭示并提供了关于一种细菌脂肪酰基-ACP/CoA硫酯酶的功能见解，该酶具有广泛的底物特异性（C12至C18），导致脂肪酸、3-羟基脂肪酸和几种甲基酮（包括2-TDC）的形成。虽然在不同的植物中已经鉴定出甲基酮生物合成的酶，包括野生番茄的甲基酮合酶MKS2，但关于参与甲基酮生产的细菌硫酯酶的信息相当有限。

本研究首次将细菌豆科植物内共生体苜蓿根瘤菌中的SMc03960鉴定为Tol-Pal相关的YbgC样硫酯酶和MKS2同源物，当在大肠杆菌中异源表达时，主要导致甲基酮和3-羟基脂肪酸的形成。在肠杆菌中，数据表明YbgC和Tol-Pal系统共同参与磷脂代谢/稳态。需要进一步的研究努力来阐明SMc03960是否在苜蓿根瘤菌中与Tol-Pal装置一起发挥类似作用。

通过体内和体外方法的结合，研究人员表明SMc03960能够水解不同链长、氧化状态和饱和度水平的酰基-CoA和酰基-ACP。此外，通过用纯化的His-SMc03960处理合成的3-氧代-肉豆蔻酰-ACP，在体外重建了2-TDC的生产途径。这是首次在细菌YbgC样蛋白中同时证实了甲基酮生产和酰基-ACP硫酯酶活性。

SMc03960对于苜蓿根瘤菌中的甲基酮生产不是必需的。然而，与其在2-TDC生产中的作用一致，研究人员表明在苜蓿内共生体中异位表达smc03960显著增加了2-TDC的形成。SMc03960在苜蓿根瘤菌中的生理作用，包括与Tol-Pal系统的推定功能关联，以及在该细菌中参与甲基酮生产的其他酶活性的鉴定，还有待进一步研究。

同时，SMc03960广泛的底物特异性可用于生产具有工业价值的脂肪酸和脂肪酸衍生产品。这一发现不仅为理解微生物源信息化学物质的生物合成机制提供了新视角，也为工业生物技术中高效生产有价值化合物提供了新的酶学工具。