基于TMB双功能探针的比色/电化学双模式适体传感器用于高尔基体蛋白73检测及其在肝癌诊断中的应用

本工作创新性地开发了一种基于H-rGO-Mn3O4纳米酶和TMB双功能探针的双模式适体传感器，实现了对肝癌标志物GP73的超灵敏检测（检测限0.1 pg/mL），通过比色-电化学信号的自验证机制有效避免了假阳性/假阴性问题，为临床诊断提供了新策略。

　　

测定原理

相较于我们之前报道的依赖血红素（hemin）和TMB电化学还原氧化的双信号生物传感器，本研究开发了使用TMB作为双功能探针的比色/电化学双模式适体传感器用于GP73检测。该传感平台整合了H-rGO-Mn₃O₄纳米酶的信号放大作用和适体的特异性（图1A）。H-rGO-Mn₃O₄纳米酶具有强大的类过氧化物酶活性和电化学活性，能在H₂O₂存在下催化TMB氧化，产生蓝色的oxTMB（最大吸收波长652 nm）和显著的电化学信号。适体（Apt）通过π-π堆积作用固定在H-rGO-Mn₃O₄纳米酶表面，然后通过杂交与固定在金纳米粒子修饰丝网印刷电极（Au NPs/SPE）上的互补DNA（cDNA）结合。在此状态下，固定在电极表面的H-rGO-Mn₃O₄-Apt纳米复合物表现出强烈的类过氧化物酶活性，能有效催化TMB-H₂O₂系统产生强烈的比色信号（高吸光度）和明显的电化学响应（低电流）。然而，当目标物GP73存在时，适体会特异性识别并结合GP73，形成更稳定的H-rGO-Mn₃O₄-Apt/GP73复合物结构。这种结合导致纳米酶从电极表面解离。一方面，解离的纳米酶在溶液中的分散性更好，其类过氧化物酶活性得以更好发挥，理论上可能增强溶液中的比色反应。但另一方面，更重要的是，纳米酶从电极表面的脱离导致电极表面固有的类过氧化物酶活性显著降低，从而减弱了对TMB的催化氧化，导致比色信号（吸光度）降低。同时，纳米酶的脱离减少了电极表面的空间位阻和静电斥力，极大地促进了电子转移，并且游离的hemin分子（H-rGO-Mn₃O₄的一部分）可以作为有效的电子介质，催化TMB和H₂O₂之间的电化学还原反应，从而产生显著增强的电化学信号（电流增加）。因此，随着GP73浓度的增加，比色信号（吸光度）降低，而电化学信号（电流）增加。这两种信号模式相互补充，通过内置的交叉验证机制，为GP73的检测提供了高准确性和可靠性，有效消除了潜在假阳性或假阴性结果。

结论

总之，我们在这项工作中通过整合H-rGO-Mn₃O₄纳米酶和TMB作为双功能信号传感器，成功开发了一种用于GP73检测的自验证双模式适体传感器。设计的H-rGO-Mn₃O₄纳米复合材料——由hemin、Mn₃O₄和石墨烯纳米片组成——表现出协同增强的类过氧化物酶活性，能够在H₂O₂存在下有效催化TMB氧化成oxTMB。该反应产生两种互补的信号：比色读数（oxTMB在652 nm处的吸光度）和电化学响应（源自hemin-TMB-H₂O₂系统的催化还原电流）。传感机制依赖于GP73触发适体构象变化，导致H-rGO-Mn₃O₄纳米酶从电极表面释放。这种释放同时抑制了比色信号（由于固定的纳米酶减少）并增强了电化学信号（由于空间位阻降低和电子转移改善）。该传感器对GP73表现出卓越的灵敏度，在0.0001至100 ng/mL的宽线性范围内，比色和电化学模式的检测限（LOD）均低至0.1 pg/mL。它在检测人血清样本中的GP73时表现出高回收率和一致性，与标准ELISA方法结果高度吻合。这种双模式平台通过内在的交叉验证能力，显著提高了检测的可靠性，有效消除了假阳性/假阴性读数，为肝癌（HCC）的临床诊断和生物标志物检测提供了一个有前景的工具。