基于靶向定量与高分辨疑似筛查联用技术揭示全球牛肉中合成代谢类固醇残留图谱

本刊推荐：为应对牛肉中合成代谢类固醇（AS）残留引发的食品安全与健康风险，研究人员开发了一种结合靶向定量与高分辨疑似筛查（UHPLC-HRMS）的综合分析策略。该方法实现了61种AS的高灵敏度检测（LOD低至0.003 μg/kg），并在全球多源牛肉样本中检出15种AS化合物，为跨境食品贸易监管与风险防控提供了关键技术支撑。

　　

合成代谢类固醇（Anabolic Steroids, AS）自20世纪30年代首次合成以来，因其能促进肌肉生长和增强体能，被运动员和健身爱好者广泛滥用，同时也被非法用于畜牧业以加速牲畜生长和提高饲料效率。然而，这些物质在动物体内代谢不完全时会残留于肉类产品中，通过食物链进入人体，可能引发激素失调、生殖异常和免疫功能受损等健康风险。尽管国际组织如国际食品法典委员会（CAC）、美国食品药品监督管理局（FDA）和欧盟已严格禁止或限制AS在食用动物中的使用，但监测盲区依然存在，尤其是对结构多样的AS缺乏系统性的筛查与定量方法。传统检测技术如液相色谱-质谱联用（LC-MS）虽灵敏度高，但前处理复杂、覆盖化合物有限，且难以应对新兴或未知AS衍生物的挑战。因此，开发一种高效、全面的AS残留分析策略迫在眉睫。

为应对这一挑战，研究人员在《Current Research in Food Science》发表论文，通过整合靶向定量和高分辨疑似筛查技术，建立了一种适用于复杂食品基质中AS残留检测的高通量方法。研究团队优化了样品前处理流程，采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）进行靶向定量分析，并结合超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）进行疑似筛查，最终在全球来源的牛肉样本中成功鉴定出15种AS化合物，揭示了不同地区的污染特征与潜在风险。本研究不仅为AS残留的监管提供了可靠的技术手段，也为国际食品安全政策的制定提供了科学依据。

研究采用了几项关键技术方法：首先，通过比较三种样品前处理方式（包括冷诱导液液萃取CI-LLE、固相萃取SPE和酶水解结合SPE），最终选择90%乙腈-水提取结合Captiva EMR-Lipid SPE柱净化，以平衡亲水性和疏水性化合物的回收率；其次，利用UHPLC-MS/MS在计划多反应监测（sMRM）模式下对61种AS标准品进行靶向定量，并通过UHPLC-HRMS在数据非依赖采集（DIA）模式下进行疑似筛查，依托ChemSpider和MzCloud数据库进行化合物 annotation；样本队列涵盖来自美国、中国、俄罗斯、南美（智利、乌拉圭、巴西、阿根廷）和大洋洲（澳大利亚、新西兰）的29份牛肉样品，通过在线进口平台和超市采购，在冷链条件下运输并储存于-20°C直至分析。

3.1. 疑似筛查

通过高分辨质谱数据与公共数据库匹配，研究团队在牛肉样本中初步筛选出十类化学物质，包括内源性代谢物、芳香烃、羧酸/酮类、氨基酸、类固醇激素（94种）、滥用药物（91种）等。类固醇激素类别中，通过碎片谱匹配和同位素模式验证，成功注释出多种AS及其衍生物，为后续靶向定量提供了候选化合物清单。

3.2. 靶向合成代谢类固醇方法开发

3.2.1. 仪器条件优化

比较多种色谱柱（如Luna Omega PS C18、XBridge? C18等）后，最终选择Waters ACQUITY? UPLC BEH C18柱（100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm），并以甲醇为有机相、0.2%乙酸-2 mM甲酸铵水溶液为水相，显著提高了目标化合物的离子化效率和响应值。质谱参数通过优化离子对和碰撞能量，增强了检测灵敏度和特异性。

3.2.2. 样品前处理选择

通过比较三种前处理方法的回收率和基质效应，研究发现Method 2（90%乙腈提取结合SPE净化）在疏水性化合物（如睾酮Testosterone、米勃酮Mibolerone）和亲水性化合物（如克仑特罗Clenbuterol）中均表现出最佳回收率（60.95–68.03%）和较低的基质效应（平均84.74%），而Method 1（CI-LLE）和Method 3（酶水解+SPE）因提取效率低或基质干扰高而被排除。

3.2.3. 方法验证

该方法在线性范围（R²>0.97）、检测限（LOD: 0.003–3 μg/kg）和定量限（LOQ: 0.006–10 μg/kg）方面均满足国际标准（如世界反兴奋剂机构ISL），加标回收率在52.4–126.8%之间，相对标准偏差（RSD）为1.7–19.2%，证实了方法在实际样本中的可靠性和适用性。

3.3. 牛肉样本中合成代谢类固醇的检出情况

在全球29份牛肉样本中，共检出15种AS化合物，其中1-雄烯二酮（1-Androstenedione）、甲基雄烯二醇（Methylandrostenediol）、诺乙雄龙（Norethandrolone）和屈他雄酮（Drostanolone）的检出率达100%。美国样本中AS总浓度最高（4626.79 μg/kg），但化合物多样性最低（仅5种），主要以屈他雄酮为主；巴西样本则显示出最高的化合物多样性（12种）。地区间AS分布差异显著，南美和大洋洲样本中睾酮、甲基雄烯二醇等化合物更为常见，而中国样本中检出12种AS，总浓度为1153.44 μg/kg。

4. 讨论

本研究通过靶向定量与疑似筛查的联用，不仅验证了15种AS在牛肉中的残留，还发现了9种疑似化合物（如四氢孕三烯酮Tetrahydrogestrinone、勃拉睾酮Bolasterone等），这些物质因缺乏标准品而未纳入靶向分析，凸显了高分辨筛查在发现新兴污染物方面的优势。然而，部分疑似化合物（如甲基二烯酮Methyldienolone、群勃龙Trenbolone）因保留时间与标准品不匹配而被判定为假阳性，提示数据库匹配需结合标准品验证以提高准确性。

AS残留的可能来源包括：①故意外源施用（如屈他雄酮、甲基雄烯二醇等禁用物质）；②前体类固醇的代谢转化（如诺乙雄龙代谢为19-去甲雄酮19-Norandrosterone）；③饲料或环境交叉污染。这些发现揭示了当前监管体系在跨境食品贸易中的漏洞，尤其是对代谢衍生物和环境污染源的监测不足。

与既往研究相比（如表1、表2所示），本研究首次系统评估了全球多源牛肉中AS残留的多样性与地区差异，所开发的方法在灵敏度、通量和适用性方面均优于传统技术（如GC-MS、HPLC-MS）。然而，样本量有限（n=29）且未评估膳食暴露风险，未来需扩大样本规模并开展健康效应研究。

5. 结论

本研究成功建立了一种整合靶向定量与高分辨疑似筛查的分析策略，实现了牛肉中AS残留的高灵敏度、高通量检测。方法验证表明其在线性、回收率和灵敏度方面均满足监管要求，在全球样本应用中揭示了AS残留的普遍性和地区差异，其中屈他雄酮、甲基雄烯二醇等禁用物质的高检出率提示非法使用或污染问题仍需关注。该技术为食品安全监管提供了强有力的工具，对保障消费者健康、维护贸易公平性和制定国际标准具有重要意义。