WNT4缺陷通过人类遗传学、机器学习与小鼠模型揭示心脏、膈肌与腭部发育新机制

本刊推荐：为解决WNT4基因双等位变异与SERKAL综合征中心脏缺损(VSD)、先天性膈疝(CDH)及口面裂(OFC)的病因学关联问题，研究人员开展多学科交叉研究。通过机器学习算法计算基因表型关联度(WNT4的VSD/CDH/OFC评分分别为94%/99%/98.5%)，结合新发现 consanguineous 家系与Wnt4-/-小鼠模型验证，证实WNT4缺失会导致室间隔缺损、膈肌发育异常和软腭裂，为先天畸形机制研究提供新范式。

　　

在胚胎发育的复杂交响曲中，WNT4基因如同一位重要的指挥家，调控着多个器官的形成过程。这个编码分泌性半胱氨酸丰富脂糖蛋白的基因，早在2008年就被发现与一种罕见的常染色体隐性遗传病——SERKAL综合征相关，其特征包括46,XX性反转以及肾脏、肾上腺和肺的发育不良。然而令人困惑的是，尽管在最初发现的近亲家系中部分胎儿存在室间隔缺损(VSD)、先天性膈疝(CDH)和口面裂(OFC)等异常，这些表型在Wnt4基因敲除小鼠中却未被观察到，这使得研究者们无法确定这些畸形是否真正由WNT4功能缺失引起。

这个悬而未决的问题吸引了来自贝勒医学院分子与人类遗传学系的研究团队的关注。由Daryl A. Scott领导的研究团队采用了一种创新的多学科研究方法，将人类遗传学、机器学习算法和小鼠模型有机结合，试图解开这个科学谜团。他们的研究成果最终发表在《Developmental Biology》期刊上，为理解WNT4在胚胎发育中的多重作用提供了新的见解。

研究团队运用了几个关键技术方法：首先开发了基于机器学习的基因表型关联分析算法，整合Gene Ontology、MGI表型注释、蛋白质相互作用网络等多源基因组数据，计算所有RefSeq基因与已知VSD、CDH和OFC致病基因的相似性评分；通过临床外显子组测序技术鉴定新的SERKAL综合征家系致病突变；采用显微CT扫描和三维重建技术对小鼠胚胎进行高分辨率表型分析；运用蛋白质结构预测和分子建模分析致病突变的功能影响；建立Wnt4^GCE敲除/敲入小鼠模型进行功能验证。所有人类研究均获得知情同意，动物实验遵循NIH指南并获得贝勒医学院动物护理与使用委员会的批准。

WNT4与已知致VSD、CDH和OFC基因高度相似

研究人员首先使用机器学习算法，将WNT4与已知引起VSD、CDH和OFC的基因进行比较。结果显示，WNT4针对这些先天性异常的排名注释评分分别达到94%、99%和98.5%，表明它与这些表型的致病基因具有高度相似性。这一发现得到了表达研究的支持——WNT4在发育中的小鼠心脏房室管心内膜、膈肌以及前腭上皮细胞中均有表达。

第二个SERKAL综合征近亲家系的发现

研究团队报告了一个新的近亲阿富汗家系，该家系中一个受影响胎儿患有CDH，一个受影响儿童患有OFC。通过临床三重外显子组测序，发现了一个纯合的c.872C>G, p.(Thr291Arg) [NM_030761.5] 意义未明变异。蛋白质结构预测表明，该变异可能导致3个氢键丢失和19个空间位阻，严重影响WNT4蛋白的折叠和结构与受体结合能力。

SERKAL致病性WNT4变异的计算机蛋白质建模

研究人员通过多重蛋白质比对和结构分析发现，苏氨酸291(T291)位于WNT4的"食指"区域与"手掌"区域的交界处，而"食指"区域正是与Frizzled受体富含半胱氨酸结构域(CRD)相互作用的关键部位。p.(Thr291Arg)变异可能通过影响蛋白折叠和受体结合导致功能丧失。

部分Wnt4缺失胚胎出现VSD

通过杂交Wnt4^+/-小鼠并收集E15.5-E16.5胚胎，研究发现33%(3/9)的Wnt4^-/-胚胎存在膜周部VSD，而所有野生型胚胎(16/16)室间隔均完整。这一发现得到了显微CT分析的证实，56%(5/9)的Wnt4^-/-胚胎和新出生幼崽存在VSD。

部分Wnt4缺失胚胎膈肌前后部存在非肌肉化区域

对E17.5-E18.0胚胎膈肌的显微解剖显示，所有Wnt4^-/-胚胎(7/7)前膈肌肌肉化区域之间存在大间隙，57%(4/7)存在后膈肌肌肉缺失或变薄。这些非肌肉化区域似乎冗余或形成囊袋，很可能代表囊状疝的膜性覆盖物。

显微CT分析确认Wnt4缺失胚胎和新出生幼崽存在VSD、CDH和软腭裂

通过盲法显微CT表型分析，研究发现89%(8/9)的Wnt4^-/-胚胎和新出生幼崽存在肾脏变小或缺失，56%(5/9)存在前囊状CDH，33%(3/9)存在后囊状CDH。最重要的是，89%(8/9)的Wnt4^-/-胚胎和新出生幼崽存在软腭裂，而这一表型在野生型对照组中完全不存在。

研究结论和讨论部分强调，这项工作首次提供了令人信服的证据表明WNT4功能缺失足以导致哺乳动物出现VSD、CDH和腭部异常。尽管SERKAL综合征患者中仅有一例报道有VSD，但小鼠模型中44.4%(8/18)的Wnt4^-/-胚胎和新出生幼崽存在这种心脏缺陷，提供了统计学上显著的证据(P = 0.0011)支持WNT4缺陷与VSD之间的因果关系。

特别值得注意的是，人类与小鼠在表型表达上存在差异：SERKAL综合征患者表现为双侧膈肌发育不全和唇腭裂，而Wnt4^-/-小鼠则表现为前後囊状疝和软腭裂。这种物种差异在其他CDH相关基因中也有观察到的，反映了遗传背景和发育机制上的差异。

从机制角度来看，WNT4在房室管心内膜中的表达及其与SOX7、BMP2信号的相互作用，为理解VSD的形成提供了分子基础。同样，WNT4在发育中膈肌的表达以及SOX7（WNT4的上游激活因子）缺陷也可引起类似膈肌异常，表明可能存在共同的信号通路调控机制。

这项研究的重要意义不仅在于扩展了SERKAL综合征的表型谱，证明了WNT4缺陷与心脏、膈肌和腭部发育异常的因果关系，更展示了一种高效的研究范式——通过机器学习方法优先筛选候选基因，再通过靶向小鼠表型分析进行功能验证。这种多学科交叉研究方法特别适用于罕见病研究，其中患者数量有限但基因功能复杂多样。

此外，研究还揭示了在先前分析过的小鼠模型中可能会遗漏关键表型，强调了靶向表型分析在功能基因组学研究中的重要性。未来研究需要进一步阐明WNT4在膈肌和腭部发育中的具体分子机制，以及为何人类和小鼠在表型表达上存在差异，这些问题的解答将为先天性畸形的预防和治疗提供新的思路。