重构黄嘌呤脱氢酶电子受体区实现翻译后修饰非依赖型一步合成黄嘌呤氧化酶的工程化研究

本文创新性地通过理性设计黄嘌呤脱氢酶（XDH）的电子受体区域，成功实现了不依赖翻译后修饰（PTM）的一步法合成高活性黄嘌呤氧化酶（XOD）。该研究突破了传统PTM转化效率低、不可控的技术瓶颈，为氧化还原酶的辅因子工程提供了全新策略，在工业生物催化与医学检测领域具有重要应用价值。

　　

Highlight

Strains, plasmids, reagents and equipments

大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α被用作宿主菌株。引物（详见补充表S1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。携带重组质粒的大肠杆菌在添加氨苄青霉素（50 μg/mL）的LB培养基中于37°C培养16小时。细胞密度通过测量600 nm波长下的吸光度（OD₆₀₀）来确定，使用UV-6100型紫外/可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司），该仪器也用于25°C下的动力学测定。质粒pTrc-AbXH3用于表达目的蛋白。

Rational design of mutations

基于荚膜红杆菌（Rhodobacter capsulatus）CGMCC 1.3366来源的RcXDH（Wang et al., 2017a）的理论模型与实验结构（包括荚膜红杆菌B10菌株的RcXDH（PDB ID: 2W54）、牛源黄嘌呤脱氢酶BtXDH（PDB ID:1FO4）及牛源黄嘌呤氧化酶BtXOD（PDB ID: 1FIQ））的序列和结构比对（补充图S3），我们理性设计了22个RcXDH突变体。这些突变体分为四类：1）位于关键NAD结合环（由第352位氨基酸组成的³⁵²KLSKRFDQDISA³⁶⁴序列构成）上的突变；

Discussion

调控酶学氧化还原辅因子的利用不仅是关键科学问题，也是工程化细胞代谢的重要手段。例如，平衡辅因子可用性能够消除氧气需求、提高稳态代谢物水平或优化途径产量（Bastian et al., 2011; Bengtsson et al., 2009; Hasegawa et al., 2012）。正因如此，在蛋白质工程研究中切换酶的辅因子偏好性受到了广泛关注（Cahn et al., 2017）。