综述：天然酚类化合物作为多靶点抗菌剂用于食品保鲜的作用机制

本综述系统探讨了天然酚类化合物作为多靶点抗菌剂在食品保鲜中的应用及其分子机制。文章详细阐述了酚类物质（如芝麻籽蛋白水解物SSPH）通过微水凝胶（由明胶GL和乳清蛋白分离物WPI构成）封装技术，显著提升其包封率（EE达84.20%）、溶胀度（SW为31.67%）和抗氧化活性（DPPH清除率83.28%，ABTS清除率85.73%）。研究证明该体系能有效控制活性肽在胃肠道中的释放（胃部释放35.34%，肠道释放59.19%），并改善发酵豆奶的流变特性、益生菌存活率及感官品质，为天然抗菌剂在功能食品开发中提供创新策略。

　　

引言

功能食品因其超越基础营养的健康益处而受到广泛关注，包括改善消化功能、支持免疫系统和降低慢性疾病风险。发酵豆奶作为典型功能饮料，通过益生菌（如乳酸杆菌或双歧杆菌）发酵豆奶制成，其营养价值和健康促进特性通过提高矿物质生物利用度（钙、铁、锌）、减少抗营养素（如植酸）以及通过部分分解提高蛋白质和复杂糖类的消化性而得到增强。豆奶中的异黄酮（植物雌激素）与益生菌结合，可能降低低密度脂蛋白（LDL）胆固醇水平并有助于激素平衡，特别是在女性中。

从植物种子中获得的生物活性肽显示出多样化的健康促进效果。这些肽是通过蛋白水解酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶或碱性蛋白酶）对种子蛋白质进行酶解而得到的短链氨基酸，提供各种功能和营养保健益处。具体而言，芝麻籽肽表现出抗氧化、抗高血压、抗炎、抗菌、降低胆固醇和免疫调节活性。然而，将芝麻籽肽纳入食品系统存在与其在加工和消化过程中的稳定性和生物利用度相关的挑战。肽在恶劣的胃肠道条件下可能降解，由于与其他食品成分的相互作用而失去生物活性，或对感官属性产生负面影响。这些限制降低了它们的功能效力，并凸显了对保护性递送系统的需求。

为了最大化肽的生物活性潜力，必须保护它们免受恶劣的酸性和碱性条件的影响。因此，基于天然生物聚合物（如各种蛋白质和多糖）可以设计靶向递送和控释生物活性成分。微水凝胶是小的、水溶胀的生物聚合物网络，作为生物活性化合物的有效载体。这些递送系统嵌入敏感分子，如维生素、肽或植物提取物，保护它们免受降解，并在胃肠道、食品、制药和化妆品应用中实现控释。

材料与方法

材料

乳清蛋白分离物（WPI）购自Hardline Nutrition（Kavi Food Ltd. Co.，伊斯坦布尔，土耳其），其蛋白质含量通过凯氏定氮法测定为88.5%（w/w）。来自猪皮的明胶（GL），凝胶强度约为175 g Bloom，A型，由Sigma-Aldrich Co.（德国）提供。甘油、甲醇、ABTS（2,2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸））、DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）和铁还原抗氧化能力（FRAP）测定试剂盒（比色法）购自Merck Co.（德国）。

微水凝胶的制备

使用明胶（GL）和甘油以1:1（w/w）的比例结合乳清蛋白分离物（WPI）在特定浓度下制备水凝胶样品，如表1a所示。将WPI溶解在蒸馏水中，以800 rpm搅拌2小时以获得均质溶液，初始pH约为6.0。 separately，将GL在60°C的预热水溶解，然后进行超声处理以去除泡沫，在此温度下得到的pH约为5.9。随后，将WPI溶液与GL-甘油溶液在受控条件下混合，并加入大豆蛋白分离物（SSPI）或水解大豆蛋白（SSPH），浓度如表1a所列。得到的配方在标准条件下凝胶，产生十二种不同的处理（T1–T12），具有不同的组成和包封效率（EE）和溶胀度（SW），如表1a总结。

芝麻籽蛋白分离物及其水解物的封装

将GL和WPI溶液以500 rpm在环境温度下混合2小时，以达到表1a中提到的比例。得到的混合物在4°C下储存过夜。然后，将混合物以100 W超声1分钟，随后加入芝麻籽蛋白分离物（SSPI，88.90% w/w蛋白质含量）和芝麻籽蛋白水解物（SSPH），水解度为16.37%（在我们之前的研究中使用5% w/w的Alcalase制备；在50°C下水解4小时）。SSPI和SSPH的浓度在最终微水凝胶配方中达到100 μg/mL。得到的微水凝胶以800 rpm搅拌10分钟。微水凝胶的pH为6.5。之后，将负载SSPI和SSPH的水凝胶以9000 rpm离心30分钟。收集残留沉淀，与5 mL双重蒸馏水混合，得到的混合物进行冷冻干燥。

负载SSPI或SSPH的微水凝胶的表征

包封效率

开发微水凝胶的包封效率（EE%）定义为封装SSPI或SSPH与总SSPI或SSPH的比例×100。相应地，使用二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）评估水凝胶系统中剩余的自由和未封装的SSPI或SSPH的量。封装（结合）材料通过差值确定为总SSPI或SSPH – 自由SSPI或SSPH。将1 mL新鲜制备的水凝胶转移到微量离心管中，以8000×g在室温下离心10分钟，以从水凝胶基质中分离未封装的蛋白质。小心收集上清液。然后，使用3 kDa超滤离心过滤器（EMD Millipore，Temecula，CA，USA）以10,000×g离心15分钟过滤0.5 mL上清液，以去除任何残留的水凝胶颗粒，并确保只有自由SSPI或SSPH通过。之后，将0.1 mL滤液与制备的BCA试剂以20:1（v/v）混合。将混合物在室温下孵育2小时，以允许颜色完全发展。制备的样品在室温下保持2小时，然后使用紫外-可见分光光度计在562 nm读取吸光度。此外，没有SSPI或SSPH的水凝胶被离心、过滤，并用作分光光度计的空白。使用已知浓度的SSPI或SSPH在相同缓冲液中作为水凝胶上清液制备标准校准曲线，并从该曲线确定自由蛋白质浓度。最后，使用公式计算EE（%）：EE（%）=（（总蛋白质 - 自由蛋白质）/总蛋白质）×100。

溶胀度

通过将水凝胶浸入蒸馏水中并在时间间隔内测定其重量，直到达到恒定重量，来测量所生产微水凝胶的溶胀度（%）。将干燥样品（约0.2 g）放入预湿润的茶袋中，密封，并置于水介质中溶胀。初始2小时后，样品以5分钟间隔从水介质中排出。用滤纸擦拭去除表面附着水，然后称重样品。然后，在5小时内以15分钟间隔称重样品，随后每天一次，持续8天，直到平衡。使用关系式（（茶袋重量（W1）、干燥水凝胶（W2）和溶胀水凝胶重量（W3））计算溶胀度（SW%）：SW（%）=（（W3 - W2 - W1）/W2）×100。

抗氧化活性

DPPH自由基清除活性

根据Zhang等人（2022）的方法评估开发水凝胶的DPPH自由基清除活性。基于建议的方法，将微水凝胶在40°C加热。用于测量，将1 mL水凝胶与1 mL新鲜的100 μM DPPH乙醇溶液混合，得到的混合物在黑暗环境中在环境温度下孵育30分钟。使用紫外-可见分光光度计在517 nm读取混合物的吸光度。此外，将1 mL去离子水与1 mL DPPH溶液混合，读取吸光度，并视为对照。最后，使用以下关系确定DPPH RSA（%）：DPPH RSA（%）=（（A_C - A_S）/A_C）×100。

ABTS自由基清除活性

根据Lin等人（2024）的方法测量水凝胶的ABTS RSA（%）。简要地，将3.5 mM ABTS与1.2 mM过硫酸钾溶液混合，并保持16小时以提供ABTS自由基阳离子，并避光。通过稀释将制备溶液的吸光度设置为0.7 ± 0.02。用于测量ABTS RSA（%），将1 mL水凝胶与1 mL ABTS·⁺溶液使用实验离心管混合，并在室温下保持10分钟。使用紫外-可见分光光度计在734 nm记录吸光度。使用以下关系计算ABTS RSA：ABTS RSA（%）=（（A_C - A_S）/A_C）×100。

铁还原抗氧化能力

用于测量Fe（III）还原活性或FRAP，将1 mL水凝胶与2.5 mL磷酸盐缓冲液0.2 M（pH 6.6）和2.5 mL铁氰化钾1%混合，得到的混合物在50°C孵育30分钟。之后，将2.5 mL三氯乙酸10%加入到反应混合物中，并在室温下以1650×g离心10分钟。收集上清液（2.5 mL）并与2.5 mL去离子水和0.5 mL FeCl₃混合，保持10分钟。在700 nm记录吸光度，而去离子水视为对照。应注意较高的吸光度表示较高的还原活性。

颗粒特征

尺寸分布

使用Mastersizer 3000（Malvern Instruments Ltd.，Worcestershire，UK）测量所选水凝胶（T8）的液滴尺寸分布。将水凝胶使用双重蒸馏水稀释100倍，并使用NaOH将pH设置为7.0。液滴尺寸报告为平均直径。

Zeta电位

使用Zetasizer（Nano-ZS，Malvern Instruments，Worcestershire，UK）测量所选水凝胶（T8）的zeta电位。将水凝胶使用双重蒸馏水稀释100倍，并使用NaOH将pH设置为7.0。Zeta电位报告为平均值。

热性质

通过差示扫描量热法（DSC，Mettler Toledo DSC instruments，USA）评估冷冻干燥所选微水凝胶（T8）的热性质。用于测量，称量15 mg样品并置于铝盘中。然后，将盘密封并在0至200°C以10°C/min的速率加热。此外，在相同条件下加热密封的空盘并视为参考。还通过DSC评估微水凝胶的组成成分，即GL、WPI和SSPH，并与所选微水凝胶进行比较。

形态性质

使用扫描电子显微镜（SEM，FEI Nova NanoSEM 430，Oregon，USA）评估所选冷冻干燥微水凝胶的形态特征。将微水凝胶金溅射至5 nm厚度，然后在26 kV加速电压下使用SEM分析。以500倍放大进行成像。

化学性质

通过傅里叶变换红外光谱（FTIR，Thermo Fisher Scientific Co.，Ltd.，Waltham，MA，USA）评估冷冻干燥所选微水凝胶及其组成成分的化学性质。用于测量，在FTIR分析之前，将微水凝胶样品及其组成成分压在KBr片中。然后，以4 cm^?1的分辨率进行光谱采集。

胃肠道命运

基于Mohammadi等人（2023）的方法研究封装SSPH在所选微水凝胶（T8）中的体外释放。制备模拟胃肠道道（GIT）条件，包括胃（胃）和小肠阶段，然后使用摇床培养箱在37°C进行消化。

胃阶段

通过将2 g NaCl、7 mL HCl 6 M和3.2 g胃蛋白酶溶解在1 L蒸馏水中来制备模拟胃液（SGF）。然后，将微水凝胶与SGF以1:1的体积比混合，同时将pH调节至1.5，样品孵育2小时。

小肠阶段

通过将6.8 g K₂HPO₄、8.775 g NaCl、5 g胆汁盐和3.2 g胰酶溶解在1 L蒸馏水中来制备模拟肠液（SIF）。首先，将胃SGF的pH设置为6.8，以为胰酶活性提供最佳条件。然后，从SGF阶段结束收集的微水凝胶样品与SIF以1:1的体积比混合，并孵育2小时。为了终止酶活性，将混合物在85°C加热15分钟。

释放曲线

通过监测其在模拟消化系统中预定时间间隔的释放速率来研究封装SSPH从所选微水凝胶的释放曲线。用于测定释放速率，从每个消化阶段取出1000 μL消化样品，并使用冰浴冷却。通过将消化样品转移到超离心Amicon过滤器的上部，随后以4000 rpm离心15分钟，来定量水解物释放。收集滤液，使用邻苯二醛（OPA）测定法确定SSPH的释放含量。此外，使用L-亮氨酸绘制标准曲线。SSPH的累积释放速率随时间说明如下：累积释放（%）= Σ₀^t（M0/Mt），其中M0和Mt分别表示未消化微水凝胶中SSPH的初始量和消化微水凝胶中每次取样的累积释放SSPH量。

发酵豆奶制备

豆奶制备

使用Kumari等人（2022）的方法生产豆奶。为此，将大豆在含有0.5% NaHCO₃的蒸馏水中浸泡过夜。然后，冲洗大豆，加热，去壳，并与水混合4次以提取过滤豆奶，随后在90°C加热10分钟。

鼠李糖乳杆菌接种物制备

使用De Man–Rogosa–Sharpe琼脂（MRS琼脂）通过