基于qPCR的隐孢子虫常规监测与暴发调查分子诊断方法开发及验证

本文推荐一种基于qPCR的隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）分子检测方案，该方案通过大体积水样过滤、热-机械-酶学细胞破壁技术和优化qPCR体系，显著提升检测灵敏度与重现性。经验证，方法回收率高达55.1%，可检出每样本低至9个卵囊，成本降低35%以上，为水质安全监测及暴发溯源提供快速、可靠且符合法规（如ISO 15553）的分子解决方案。

　　

亮点（Highlights）

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  开发并验证了一种可定量检测多种水基质中隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）和微小隐孢子虫（C. parvum）的qPCR分子诊断方案

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  方法整合大体积水样过滤、热-机械-酶促细胞破壁（thermal-mechanic-enzymatic disruption）及优化qPCR体系，具备高灵敏度与重现性

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  检出限低至每样本9个卵囊，回收率最高达55.1%，较传统方法（IMS-IM）成本降低超35%

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  成功应用于近期暴发事件调查，支持法规化环境监测

方法（Methods）

所有实验均在通过ISO/IEC 17025和ISO 9001认证的实验室内完成。全程遵循标准操作程序（SOP），从样本浓缩至数据分析。每批次4–8个样本（即10 L）全程耗时约3.5小时。推荐实验环境条件为：温度20–25°C，相对湿度40–60%。

结果与讨论（Results and discussion）

所有阴性对照（NES、EEC、PEC）均无扩增，表明实验流程无污染。若任一对照出现阳性，则该批全部样本需作废，并排查污染来源。

共分析196份水样，其中80份检测隐孢子虫属（C. spp）（饮用水=50，原水=19，再生水=11），116份检测C. parvum（饮用水=70，原水=30，再生水=16）。

结论（Conclusions）

本方法可实现物种水平定量检测，克服了传统镜检因隐孢子虫形态相似而无法区分物种的局限。此外，作为一种免免疫磁分离（IMS-IM）的方法，其具备更快获果、更低耗材成本及更易判读等优势。未来改进应聚焦于引入可同时检测C. parvum与C. hominis的多重qPCR体系。