基于qPCR的水体隐孢子虫检测方法开发与验证：一种快速、灵敏且经济高效的分子诊断策略

本文推荐一种基于qPCR（定量聚合酶链反应）的分子检测方案，用于高效检测水体中隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）和小隐孢子虫（C. parvum）。该方法通过大体积水样过滤、热-机械-酶促细胞裂解及优化qPCR体系，实现高灵敏度（低至9个卵囊/样本）、高回收率（达55.1%）和低成本（较传统IMS-IM降低35%以上），为水体隐孢子虫监测提供了可靠、快速且可扩展的替代方案。

　　

亮点

我们开发并验证了一种基于qPCR（定量聚合酶链反应）的分子检测方案，用于检测不同水体基质中的隐孢子虫属（Cryptosporidium spp.）和小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）。该方法包括大体积水样过滤、热-机械-酶促细胞裂解以及优化的qPCR检测，最终形成了一种高灵敏度且可重复的方法。我们评估了其敏感性、特异性、浊度干扰，并与传统的免疫磁分离-免疫荧光显微镜（IMS-IM）方法进行了性能比较。经过27个月的验证，该方法表现出稳健的性能，回收率高达55.1%，每个样本可检测到低至9个卵囊，且与传统方法相比成本降低了35%以上。该方法在近期疫情调查中成功应用，为环境隐孢子虫监测提供了一种可靠、快速且可扩展的替代方案，具有融入监管框架的强大潜力。

结论

本文所述方法实现了病原体在物种水平上的定量检测，这与经典显微镜检测方法因隐孢子虫物种形态相似而无法区分形成鲜明对比。此外，这是一种无需免疫磁分离-免疫荧光显微镜（IMS-IM）的方法，具有更多优势，包括更快的得出结果时间、降低耗材成本以及比免疫荧光显微镜（IM）更易于结果判读。未来的改进应侧重于引入多重检测（multiplex assay），以同时检测小隐孢子虫（C. parvum）和人隐孢子虫（C. hominis）。