基于快速VPCR与核酸侧向层析免疫分析(NALFIA)联用技术实现伪中间葡萄球菌和凝固葡萄球菌的快速检测

本文推荐一种结合快速VPCR与核酸侧向层析免疫分析(NALFIA)的新型检测策略，可在45分钟内通过肉眼判读结果，实现对犬脓皮症主要病原体——伪中间葡萄球菌(SP)和凝固葡萄球菌(SC)的灵敏检测（凝胶电泳灵敏度达102 CFU/mL）。该方法突破了传统PCR依赖凝胶电泳设备的限制，为资源有限环境下的即时检测(POCT)提供了高效解决方案。

　　

Ethical approval

我们获得了宠物主人的知情同意，本研究未涉及侵入性操作，皮肤拭子采集仅用于临床诊断目的，结果均予以保密。

Institutional biosafety committee approval

本研究经机构生物安全委员会批准（批件号：VIII-Approval Lr. No.2286/DFBS/4/IBSC/2017，日期：2017年10月10日），批准机构为印度泰米尔纳德邦金奈马德拉斯兽医学院校区基础科学系主任兼院长。

Bacterial isolates

脓性拭子样本采集自犬脓皮症病例，用于分离伪中间葡萄球菌(SP)和凝固葡萄球菌(SC)菌株。

DNA extraction

本研究采用NaOH裂解法提取细菌DNA，该方法简单快速、成本低廉。所制备DNA的260/280比值介于1.65-1.95之间，浓度范围为32-87 ng/μL。由于DNA浓度存在差异，特异性研究均使用100 ng/反应体系；灵敏度研究则根据麦氏浊度标准提取DNA，确保浓度范围集中。

Analytical sensitivity and specificity

通过特异性实验验证，VPCR-NALFIA体系能准确区分SP与SC，未出现交叉反应。灵敏度测试显示：VPCR结合凝胶电泳对SP和SC的检测限均达10² CFU/mL，而NALFIA的检测灵敏度为10⁴ CFU/mL。尽管凝胶电泳法更灵敏，但需依赖琼脂糖电泳系统、电源装置、凝胶成像系统以及致癌性溴化乙锭染料；而VPCR-NALFIA联用技术仅需45分钟即可通过肉眼实现可靠检测。

Discussion

NaOH提取DNA的基础方法源于Wang等学者1993年对植物组织DNA提取的研究，Osmundson等（2013年）进一步将其应用于真菌DNA提取。本研究创新性地使用普通蒸馏水替代100 mM Tris-HCl (pH 8.0)中和NaOH，简化了操作流程。相较于传统方法，该技术显著降低了检测成本和时间消耗，特别适用于现场快速诊断场景。