利用大肠杆菌表达人源CYP7A1高效全细胞生物催化合成7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮

本刊推荐：为解决胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）在微生物宿主中功能性表达难题，研究人员构建了共表达截短型人源CYP7A1与细胞色素P450还原酶（CPR）的大肠杆菌全细胞催化系统，通过分子伴侣协同表达与转化条件优化，实现了7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮（7α-HCO）的高效合成（118.3 mg·L?1·d?1，纯度>98%），为甾体药物中间体绿色制造及代谢疾病研究提供了创新平台。

　　

在甾体化合物合成与代谢研究领域，胆固醇7α-羟化酶（Cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1, CYP7A1）作为胆汁酸合成途径的关键限速酶，催化胆固醇转化为7α-羟基胆固醇，进而生成各类胆汁酸。这一过程不仅维持机体胆固醇稳态，更与脂质代谢、葡萄糖代谢及多种代谢性疾病（如高胆固醇血症、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝）密切相关。然而，人源CYP7A1属于膜结合型细胞色素P450酶，其功能性表达在微生物宿主中极具挑战性：不仅需要依赖特异性 redox partner 细胞色素P450还原酶（Cytochrome P450 reductase, CPR）传递电子，还存在蛋白溶解度低、催化活性弱等问题。传统化学合成7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮（7α-HCO）——CYP7A1催化胆固醇的直接产物及胆汁酸合成关键前体——往往步骤繁琐、条件苛刻、立体选择性差，难以满足大规模生产需求。因此，开发高效、高选择性的生物催化平台，实现7α-HCO的绿色合成，成为甾体药物工业与代谢研究领域的迫切需求。

针对这一难题，广州中医药大学药学系的Shang Qiannan、Huang Jiahui等研究人员在《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》上发表论文，报道了一种基于大肠杆菌的全细胞生物催化系统，成功实现了人源CYP7A1的功能性表达与7α-HCO的高效合成。该研究通过基因工程策略（包括密码子优化、N端截短）、双表达载体设计（双顺反子与双启动子系统）、分子伴侣共表达（GroES-GroEL）以及生物转化条件优化，最终筛选出高效工程菌株Rosetta(DE3)-pET-tCYP7A1-tCPR，在羟基丙基-β-环糊精（HP-β-CD）和多粘菌素B的辅助下，实现了7α-HCO产量达118.3 mg·L?1·d?1，纯度超过98%，并通过核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HR-ESI-MS）对产物结构进行了确证。

研究过程中，作者主要采用了以下关键技术方法：首先通过合成生物学手段构建了截短型CYP7A1（tCYP7A1）与CPR（tCPR）的共表达质粒系统（pET-17b与pRSFDuet-1载体）；利用分子伴侣质粒pGro7/pGro12在不同大肠杆菌宿主（C41(DE3)、C43(DE3)、Rosetta(DE3)等）中辅助蛋白折叠；通过SDS-PAGE电泳评估蛋白表达水平；建立反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法检测胆固醇转化与7α-HCO生成；结合膜透性剂（多粘菌素B）与增溶剂（HP-β-CD）优化全细胞催化反应体系；最后通过制备型HPLC纯化产物，并采用NMR和LC-MS进行结构鉴定。

3.1. Construction and verification of CYP7A1 expression plasmids

研究人员成功构建了两种共表达载体系统：基于pET-17b的双顺反子转录单元和基于pRSFDuet-1的双启动子系统。菌落PCR验证显示，所有重组质粒中均能扩增出213 bp的CYP7A1特异性条带，证实基因正确插入。

3.2. Construction and expression of recombinant E. coli strains

在5种大肠杆菌宿主中共构建12株重组菌。SDS-PAGE结果表明，Rosetta(DE3)、BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL和GSsetta(DE3)宿主中tCYP7A1表达最强，而双启动子系统（pRSFDuet-1）显著提升了CPR表达水平。截短型CPR（tCPR）的表达优于全长CPR，且分子伴侣GroEL表达与目标蛋白呈负相关。

3.3. Establishment of RP-HPLC method

建立了以乙腈:甲醇（70:30）为流动相、C18色谱柱、240 nm检测波长的RP-HPLC方法，胆固醇酮和7α-HCO的保留时间分别为25.699 min和9.569 min，分离效果良好。

3.4. Whole-cell biocatalytic activity of recombinant strains

多粘菌素B（32 μg/mL）可显著提升胆固醇转化率至60.96%（对照组42.99%），而HP-β-CD（45%）作为增溶剂效果最佳。在12株重组菌中，Rosetta-pET-tCYP7A1-tCPR表现出最高转化率（86.8%），且tCPR菌株的催化效率显著高于fCPR菌株。

3.5. Optimization of substrate concentration, resting cell density, and reaction time

当胆固醇浓度为450 μM、细胞密度为25 g/L、反应时间24 h时，7α-HCO产量最高（283.1 ± 1.3 μM）。过高底物浓度（750–850 μM）会抑制反应效率。

3.6. Structural characterization of 7α-HCO

纯化产物经NMR和LC-MS鉴定确认为7α-HCO，其¹H-NMR显示特征质子信号（δ 5.79, 3.96），¹³C-NMR显示羰基碳（δ 199.03）和烯碳（δ 168.06, 126.90）信号，分子离子峰m/z 399.3 [M+H]⁺与C₂₇H₄₄O₂理论值一致。

研究结论与讨论部分强调，该工作首次实现了人源CYP7A1在大肠杆菌中的功能性表达与7α-HCO的高效生物合成，突破了以往微生物表达该酶活性低的瓶颈。该系统具有立体选择性高、反应步骤简捷、环境友好等优势，为甾体药物中间体的绿色制造提供了新策略。尽管在底物溶解性、CPR依赖性和细胞代谢负担等方面仍存在优化空间，但通过后续的酶工程改造（如理性设计底物通道）、 redox partner 系统替换（如AdR/Adx）及过程放大研究，有望进一步提升催化效率与工业适用性。该平台不仅可用于甾体化合物的生物催化生产，还为CYP7A1相关代谢疾病机制研究、药物筛选及个性化医疗提供了重要工具。