基于雌三烯骨架的羟肟酸衍生物作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂的理性设计、合成与抗肿瘤活性研究

本刊推荐：为开发新型高效低毒抗癌药物，研究人员以雌酮和雌二醇为骨架，在3位引入不同链长烷氧链接的羟肟酸基团，设计合成了一系列雌三烯基羟肟酸衍生物。其中先导化合物CFT-2b和CEC-2b对HeLa和SKOV-3细胞表现出强效抗增殖活性(IC50为6.09–8.36 μM)和良好选择性(选择性指数SI>8.5)，其机制与诱导细胞凋亡、G1期阻滞和组蛋白H3乙酰化水平升高相关，分子对接显示其与HDAC2/6活性位点有效结合，为HDAC抑制剂研发提供了新骨架。

　　

癌症至今仍是全球第二大死因，每年导致数百万人死亡。尽管化疗是癌症治疗的基石，但多药耐药和严重副作用常常影响其疗效。因此，开发新型高效低毒的 anticancer agents（抗癌药物）迫在眉睫。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)作为表观遗传调控的关键酶，其抑制剂通过增加组蛋白乙酰化水平、调节基因表达，进而诱导细胞分化与凋亡，已成为抗癌药物研发的重要方向。其中，羟肟酸(hydroxamic acid)基团因其能够与HDAC活性位点的锌离子螯合，成为设计HDAC抑制剂的经典锌结合基团(zinc-binding group, ZBG)。2006年，首个羟肟酸类HDAC抑制剂伏立诺他(vorinostat, SAHA)获美国FDA批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤，开启了HDAC抑制剂治疗癌症的新篇章。

与此同时，甾体化合物(steroids)作为内源性分子，在生长、发育和繁殖中扮演关键角色。其良好的膜通透性使得对甾体骨架进行结构修饰，如引入杂环、杂原子或药效团（羟基、肟、腙、酰胺或巯基等），能够显著增强其抗炎、抗肿瘤和抗氧化等生物活性。例如，雌激素受体下调剂氟维司群(fulvestrant)便是成功的甾体类抗肿瘤药物。研究人员前期工作也表明，在雌二醇的3位和17位进行官能团化，可显著增强其抗肿瘤活性。

受SAHA结构特征的启发，研究人员巧妙地将雌三烯(estratriene)骨架与羟肟酸基团相结合，理性设计了一系列新型HDAC抑制剂。他们利用雌酮(estrone)和雌二醇(estradiol)为 scaffold（骨架），在其3位酚羟基通过不同链长的烷氧链接器(alkoxy linkers)引入羟肟酸基团作为ZBG，而17位的不同取代基（羰基、羟基或羟肟基）则作为 cap group（帽盖基团），旨在探索结构变化对HDAC抑制活性和抗肿瘤效果的影响，以期获得高效、高选择性的新型抗癌先导化合物。相关研究成果发表在《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》上。

为开展本研究，作者主要应用了几项关键技术方法：1) 运用Williamson醚合成法和羟胺解反应进行目标化合物的化学合成与表征（核磁共振氢谱(¹H NMR)、碳谱(¹³C NMR)和高分辨质谱(HRMS)）；2) 采用MTT法检测化合物对SKOV-3（人卵巢癌细胞）、HeLa（宫颈癌细胞）、MCF-7（人乳腺癌细胞）和293T（人肾上皮细胞，正常对照）的体外抗增殖活性并计算IC₅₀值和选择性指数(SI)；3) 使用商业化的HDAC ELISA试剂盒进行组蛋白去乙酰化酶抑制活性检测；4) 通过流式细胞术（Annexin V/PI染色）分析细胞凋亡情况，并用PI染色进行细胞周期分布检测；5) 采用蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测HeLa细胞内乙酰化组蛋白H3(Ac-H3)的蛋白表达水平；6) 利用分子对接软件(SYBYL-X 2.1.1)将先导化合物与HDAC2(PDB: 4LXZ)和HDAC6(PDB: 5EEI)的晶体结构进行对接，模拟其结合模式。

3.1. 化学合成

研究人员成功合成了两个系列的化合物：以雌酮为起始原料，经醚化反应引入不同链长的酯基中间体(CFT-1a–e)，再经羟胺解反应同时将17位酮基转化为羟肟基，得到17-羟亚氨基雌三烯基羟肟酸衍生物(CFT-2a–e)；以雌二醇为起始原料，同样经醚化得到酯基中间体(CEC-1a–e)，再经羟胺解得到17-羟基雌三烯基羟肟酸衍生物(CEC-2a–e)。所有目标化合物均通过¹H NMR、¹³C NMR和HRMS进行了确证。

3.2. 生物学评价

3.2.1. 抗增殖效应

MTT实验结果表明，羟肟酸衍生物(CFT-2(a-e)和CEC-2(a-e))的抗增殖活性显著高于其酯类前体(CFT-1(a-e)和CEC-1(a-e))。在SKOV-3、HeLa和MCF-7细胞系中，化合物对SKOV-3细胞的抑制效果最强。其中，17-羟亚氨基取代的化合物(CFT-2(a-e))活性优于17-羟基取代的化合物(CEC-2(a-e))。链长(n)对活性影响显著，当n=4时（化合物CFT-2b和CEC-2b）活性最优，其对HeLa和SKOV-3细胞的IC₅₀值分别为6.09–8.36 μM，且对正常293T细胞毒性较低，表现出良好的选择性（选择性指数SI为8.5至>13.1）。其活性虽略低于阳性药SAHA，但仍显示出良好的开发潜力。

3.2.2. HDAC抑制效应

采用HDAC酶联免疫吸附测定试剂盒评估了化合物对HDAC酶的抑制活性。结果表明，多个化合物（如CEC-2a, CEC-2b, CEC-2c和CFT-2d）的抑制活性优于阳性对照SAHA(IC₅₀ = 6.90 μM)，其中CEC-2c的IC₅₀值最低，为4.70 μM。这证实了所合成化合物确实具有HDAC靶向抑制能力。

3.2.3. 诱导细胞凋亡

通过Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测化合物对HeLa细胞凋亡的诱导作用。结果显示，CFT-2b和CEC-2b能以剂量依赖的方式诱导HeLa细胞凋亡，其中CFT-2b（17-羟亚氨基取代）的促凋亡效果略优于CEC-2b，但其效果仍稍弱于SAHA。该结果与体外抗增殖数据相一致。

3.2.4. 细胞周期分布

采用PI染色流式细胞术分析化合物对HeLa细胞周期的影响。经CFT-2b、CEC-2b和SAHA处理24小时后，HeLa细胞周期停滞在G1期的比例显著增加，表明这些化合物可能通过诱导G1期阻滞来抑制肿瘤细胞增殖。同样，CFT-2b的效果略优于CEC-2b，但均弱于SAHA。

3.2.5. 蛋白质免疫印迹评估

Western blot分析用于检测化合物对HeLa细胞内组蛋白H3乙酰化水平(Ac-H3)的影响。结果显示，经CFT-2b和CEC-2b处理的HeLa细胞，其Ac-H3水平呈剂量依赖性升高，以β-actin为内参对照。这直接证明了CFT-2b和CEC-2b能够在细胞内有效抑制HDAC活性，从而增加组蛋白乙酰化水平，与其 proposed mechanism of action（提出的作用机制）相符。

3.2.6. 分子对接研究

为探究化合物与HDAC的结合模式，研究人员选择了HDAC2（I类代表）和HDAC6（II类代表）的晶体结构进行分子对接。对接结果表明，先导化合物CFT-2b和CEC-2b与HDAC2和HDAC6均能有效结合。其结合模式高度保守：羟肟酸基团与活性位点的Zn²⁺离子发生关键性螯合，并与周围的组氨酸(His145, His146 in HDAC2; His573, His574 in HDAC6)和酪氨酸(Tyr306 in HDAC2; Tyr745 in HDAC6)等残基形成氢键网络。庞大的甾体骨架则占据了活性位点入口处的帽盖区。这些相互作用共同稳定了化合物在结合口袋内的构象，为其HDAC抑制活性提供了结构基础。

本研究成功设计、合成了两个系列的新型雌三烯基羟肟酸衍生物，并系统评价了其抗肿瘤活性及HDAC抑制机制。研究结果表明，17-羟亚氨基取代的化合物(CFT-2系列)通常表现出优于17-羟基取代化合物(CEC-2系列)的生物学活性。构效关系研究表明，连接羟肟酸基团的烷氧链接器链长对活性至关重要，其中含有4个亚甲基的链接器(n=4)为最优长度，其代表化合物CFT-2b和CEC-2b对SKOV-3和HeLa细胞展现出最强的抗增殖活性和良好的选择性。机理研究证实，这些先导化合物能够剂量依赖性地诱导肿瘤细胞凋亡、引起G1期细胞周期阻滞、并显著提升细胞内乙酰化组蛋白H3的水平，这与HDAC抑制机制一致。分子对接模拟进一步从理论上支持了化合物可通过锌离子螯合和适宜的帽盖基团定位，与HDAC2和HDAC6的活性位点发生有效结合。

综上所述，该研究不仅发现了一类具有开发潜力的HDAC抑制剂新骨架，为基于甾体结构的抗癌药物设计提供了新思路，而且通过深入的机理探讨为后续的结构优化和药理研究奠定了坚实的基础。这些雌三烯基羟肟酸衍生物，特别是CFT-2b和CEC-2b，有望成为开发新型HDAC靶向抗肿瘤药物的优秀先导化合物。