厚生物样本的剂量高效冷冻电镜成像：基于倾转校正扫描透射电镜的新方法

为解决厚生物样本在冷冻电镜成像中因非弹性散射导致的信号损失和色差模糊问题，研究人员开发了一种基于倾转校正明场扫描透射电镜（tcBF-STEM）的新型成像技术。该研究利用像素化探测器采集四维STEM数据，通过校正离轴像素的图像位移，实现了接近全入射电子信号的利用。结果显示，tcBF-STEM在500 nm以上厚度的样本中比能量过滤透射电镜（EFTEM）提升3–5倍的剂量效率，并成功以789个颗粒实现了亚纳米分辨率的单颗粒分析。该技术为厚样本的结构生物学研究提供了更高效的成像方案，有望推动细胞原位高分辨率结构解析的发展。

　　

在结构生物学领域，冷冻电子显微镜（cryo-EM）已成为解析生物大分子结构的关键工具。尤其是单颗粒分析（SPA）技术，能够以接近原子分辨率揭示纯化大分子复合体的三维结构。冷冻电子断层扫描（cryo-ET）及其子断层图平均技术则进一步拓展了原位结构研究的边界，使科学家能够在细胞切片中直接观察大分子的功能状态。然而，随着样本厚度的增加，一系列技术挑战也随之而来：非弹性散射导致电子能量损失，而后样本光学器件的色差使得这些电子无法被准确聚焦，严重降低了图像的分辨率和衬度。

传统上，能量过滤透射电镜（EFTEM）通过滤除能量损失电子来减轻色差模糊，但代价是损失了大量潜在信号，降低了成像的剂量效率。尤其在厚度超过500 nm的样本中，信号衰减呈指数增长，严重限制了cryo-ET在细胞生物学中的应用。面对这一瓶颈，研究者们开始探索扫描透射电镜（STEM）的潜力。STEM将聚焦电子束在样本表面扫描，由于成像光学位于样本之前，样本引起的色差模糊对探针尺寸的影响较小，因此理论上更适合厚样本的成像。

近年来，随着像素化探测器技术的发展，四维扫描透射电镜（4D-STEM）得以实现。该技术能够快速记录每个探针位置对应的二维汇聚束电子衍射（CBED）图，为开发新的成像模式奠定了基础。基于这一背景，Yue Yu、Katherine A. Spoth、David A. Muller、Lena F. Kourkoutis等研究人员在《Nature Methods》上发表了一项研究，提出了一种称为倾转校正明场扫描透射电镜（tilt-corrected bright-field scanning transmission electron microscopy, tcBF-STEM）的新方法，旨在实现厚生物样本的高剂量效率、高分辨率成像。

本研究主要依托4D-STEM数据采集与计算成像算法。研究人员使用EMPAD等像素化探测器在低温条件下采集衍射数据，通过测量和校正因离轴探测器像素引起的图像位移，整合所有明场（BF）范围内的电子信号，最终重构出具有相位衬度的图像。此外，通过上采样技术，实现了超出扫描奈奎斯特频率的信息恢复，显著提高了数据采集效率。样本方面，研究涵盖了完整细菌细胞、大型细胞器（如线粒体）以及高度对称的病毒样颗粒（PP7噬菌体衣壳蛋白）。成像性能通过与EFTEM在相同区域的对比进行验证，并利用单颗粒分析流程（cryoSPARC）进行三维重构。

Producing a phase-contrast STEM image

通过利用4D-STEM数据，研究人员发现每个明场范围内的探测器像素均可视为一个相干的BF-STEM探测器。根据互易定理，离轴BF-STEM成像等同于倾斜照明的TEM成像。在存在散焦和彗差等主要像差时，离轴像素生成的图像具有与轴上皮相似的衬度传递函数（CTF），校正位移后即可进行叠加，从而在保留相干相位衬度的同时利用几乎所有入射电子。

Fast data acquisition with upsampling and the CTF of tcBF-STEM

通过利用散焦引起的图像位移，研究人员开发了一种上采样算法，将重建图像的像素数量远超过所记录的衍射图案数量。以金碳标准样本为例，在8 ?扫描步长下，通过上采样恢复了2.3 ?的金晶格间距，信息传递达到扫描奈奎斯特极限的7倍，使数据采集速度提高了49倍。

Comparison of cryo-tcBF-STEM and EFTEM for imaging thick samples

在与EFTEM的对比实验中，tcBF-STEM在厚样本（如线粒体和细菌细胞）中显示出更优的衬度和信号保留能力。在线粒体样本中，tcBF-STEM在550–600 nm厚度区域仍能清晰分辨内膜双分子层，而EFTEM中这些特征变得模糊。定量分析表明，tcBF-STEM的信号保留率在较厚区域是EFTEM的3.6倍，且膜衬度和信噪比均随厚度增加而更具优势。

Single-particle analysis 3D reconstruction with cryo-tcBF-STEM imaging

研究人员进一步利用tcBF-STEM数据对PP7噬菌体衣壳蛋白进行了单颗粒分析。从19张显微图中提取的789个颗粒经过三维重构后，得到了分辨率达7 ?的结构图，并成功对接了已知的X射线晶体结构（PDB: 1DWN）。这一结果证明了tcBF-STEM在生物大分子结构解析中的可行性。

Discussion

研究表明，tcBF-STEM在厚样本成像中具有显著优势。其剂量效率在400 nm厚度时比EFTEM提高两倍，在800 nm时提高五倍。通过弹性平均自由程（λ_el = 830 nm）和非弹性平均自由程（λ_in = 310 nm）的对比，研究人员明确了tcBF-STEM的适用厚度范围。此外，与集成微分相位衬度（iDPC）等其它STEM模式相比，tcBF-STEM在低空间频率下具有更高的侦探量子效率（DQE），更适合厚样本中主要低频信息的传递。

尽管目前tcBF-STEM的数据采集速度仍受探测器限制，但随着高速探测器技术的发展，预计未来采集效率将大幅提升。此外，当前研究尚未针对束诱导样本运动进行校正，这也是未来优化的重要方向。总体而言，tcBF-STEM不仅为厚生物样本的高分辨率成像提供了新的解决方案，也为冷冻电子显微镜技术的发展开辟了新的道路。