基因组解析宏基因组学揭示48种蜱虫微生物组多样性及其与病原体互作机制

本研究针对蜱虫微生物组多样性认知不足的问题，通过长读长和短读长测序技术对1,479份中国八属48种蜱虫样本进行全基因组解析，重构7,783个细菌基因组（含1,373个物种），发现712个基因组代表32种潜在病原体，揭示营养内共生体的属级特异性分布，并通过微生物组全基因组关联分析（mGWAS）发现蜱虫遗传变异与病原体丰度及吸血、病原入侵等关键通路的关联，为蜱媒疾病防控提供重要资源。

　　

蜱虫作为专性吸血的外寄生虫，是人类和动物病原体的重要传播媒介，能够传播包括细菌、病毒和寄生虫在内的多种病原体。近年来，某些蜱虫种群的地理扩张和全球传播，以及地方性和新发蜱传疾病日益增长的趋势，给全球公共卫生和动物健康带来了重大关切。蜱虫因其分布广泛、独特的吸血行为、多样的动物宿主以及对不同环境的显著适应能力，携带着复杂的微生物群落。虽然对某些蜱种的微生物组研究已经揭示了显著的细菌多样性，但大多数蜱种的微生物组仍未被探索。迫切需要开展覆盖不同蜱属、蜱种、不同生态地理环境、吸血状态和其他生态特性的大规模样本的系统性研究。

以往的研究强调了生态地理因素和蜱虫遗传变异对蜱传细菌病原体分布的多因素影响，然而，要全面阐明蜱虫、病原体和微生物群之间复杂的三方相互作用，必须包含广泛蜱种和环境生态位的综合性研究。为此，研究人员在《Nature Microbiology》上发表了最新成果，利用长读长（nanopore）和短读长（Illumina）测序技术，对来自中国八属48种蜱虫的1,479份样本进行了大规模全基因组研究，旨在探索蜱相关细菌的多样性及其影响因素，识别潜在的蜱传病原体，研究细菌内共生体的作用及其与蜱虫和病原体的关系，并阐明蜱虫遗传变异与病原携带之间的联系。

研究人员为全面表征蜱虫基因组及其相关微生物组，从中国大陆31个省、市、自治区采集了超过16,000只成年蜱虫，代表8属48种蜱虫，覆盖了不同的生态动物区系。根据物种、性别、采集地点和吸血状态将个体蜱虫合并为1,460个样本，每个合并样本均进行了全基因组鸟枪法测序。为了探索宿主遗传分化与生态环境适应在蜱虫微生物组中的潜在联系，研究人员首先从全基因组测序数据中从头组装了所有48种蜱虫的线粒体基因组。基于线粒体的系统发育证实了每个蜱种的形态学分类，强化了本研究中宿主背景信息的准确性。进一步分析显示，地理距离与遗传分化之间存在正相关关系，表明蜱虫的遗传进化变异可能在其适应不同生态环境中扮演关键角色。

由于核酸是从整只蜱虫中提取的，必须在宏基因组数据中消除宿主来源的序列干扰。目前，在中国分布的蜱种中，仅有六个物种拥有公布的基因组组装。为弥补基因组信息的缺乏，研究人员将来自不同地点的每个蜱种的样本合并进行纳米孔测序，通过从头组装成功获得了19个蜱种的基因组草图，其中13个为新测序物种。这些基因组提供了有用的基因组完整性（81±11%），但连续性较低（N50=70±61 Kb），可能是由于测序覆盖度低和种内变异性高。利用这些草图基因组，研究人员有效过滤了蜱虫序列，每个样本保留了中位数15.6%的Illumina读数用于微生物组分析，该方法还促进了从纳米孔测序数据中鉴定出33个环状细菌基因组，为后续的微生物组研究奠定了关键基础。

通过整合短读长和长读长测序数据，研究人员使用从头宏基因组组装流程，共获得了10,702个宏基因组组装基因组（MAGs）。经过质量控制步骤后，重点关注7,783个中等质量或更好的MAGs，满足至少50%完整性和小于10%污染的标准。基于这些MAGs之间的平均核苷酸一致性（ANI）计算，生成了1,373个聚类。选择每个聚类中质量最高的代表性MAGs（rMAGs）构建最大似然系统发育树，这些rMAGs主要分为八个细菌纲。在分析的蜱属中，从351份扇头蜱属（Rhipicephalus）样本中获得2,952个细菌基因组，从血蜱属（Haemaphysalis）中获得2,025个细菌基因组。仅从两个样本中采样的锐缘蜱属（Argas）产生了32个细菌基因组。

值得注意的是，在前50个聚类中，考克斯体（Coxiella）和类考克斯体细菌的基因组最为主要，其次是立克次体（Rickettsia），两者都是常见的内共生体。在1,373个rMAGs中，约三分之二被暂时归类为未定义物种，因为它们的ANI值低于95%。ANI高于95%的rMAGs的蛋白质序列与NCBI非冗余（NR）蛋白质序列数据库中的已知细菌显示出近100%的相似性，而其余908个rMAGs的蛋白质与任何已知细菌物种都高度不同。这些发现突显了蜱相关微生物群未被探索的巨大多样性，强调了尚未被表征的先前未描述的细菌物种的潜力。

随后，通过分析不同蜱属、蜱种和地理区域微生物群落的变化，研究人员识别了蜱微生物组的宿主和区域特异性特征。通过比较样本量超过10的18个蜱种的微生物携带相似性，识别出六个不同的聚类，基于微生物组成模式。聚类I至III似乎主要受地理分布的影响，而聚类IV和V的组成可能很大程度上由它们的共同分类谱系解释。这些发现强调了地理和分类学因素在塑造蜱相关微生物组中的影响，为了解蜱虫、其微生物群落和环境因素之间复杂的关系提供了关键见解。

为了深入探究塑造蜱虫微生物组的因素，研究人员进行了分类学分析，以检验微生物组成与生态地理因素、动物宿主和蜱虫生物学特性之间的关系。引入了“生态型（ET）”这一同义词，根据微生物丰度谱对蜱虫微生物组进行分类，并研究这些分类的特征和关系。识别出五种不同的蜱虫微生物组生态型，每种由特定的细菌类群主导。在不同生态型中，观察到优势细菌比例的显著变化，ET1、ET2和ET3的中位数比例超过50%。α多样性在不同生态型之间存在显著差异，从ET1到ET5逐渐增加。

为了检验蜱虫、其宿主、栖息地和环境条件对蜱相关微生物群落的影响，使用了基于Bray-Curtis距离的置换多元方差分析（PERMANOVA）。值得注意的是，与湿度和温度相关的环境因素对微生物组产生了显著影响。在不同生态型中，ET2和ET4显示出相似的环境影响模式，特别是在蜱种、宿主、区域、平均相对湿度、平均日降水量和最大降水量方面，表明共享的环境驱动因素或相互作用塑造了微生物群落动态。

为了进一步探索蜱种、宿主和地理位置如何与蜱微生物群落的生态型相关联，使用卡方检验评估了生态型与因素之间的关联。ET1与特定的蜱种、其自由生活状态及其在中国东北和内蒙古-新疆地区的流行呈显著正相关。ET1以立克次体（Rickettsia）为主导，这些立克次体是垂直传播的，从而减少了对从动物宿主获取细菌的依赖。这强调了自由生活状态作为ET1的关键决定因素的重要性。

此外，为了分析蜱种、地理区域和宿主对微生物群落的相互作用，系统地控制了其中两个因素，并评估了剩余因素对微生物组变异的贡献。当蜱种和宿主都被控制时，地理区域对微生物群落的影响不大。然而，所有其他比较都揭示了显著差异，突出了在这些因素共同影响下蜱虫微生物组的显著变异性。以最丰富的血蜱属（Haemaphysalis）为例，研究了区域和宿主因素对微生物组组成的影响。寄生宿主上的样本显示出其微生物群落被分类为ET2或ET4的较高概率，而自由生活的样本则含有更丰富的放线菌（Actinobacteria）、α-变形菌（α-proteobacteria）和β-变形菌（β-proteobacteria）。寄生在牛或羊品种上的蜱虫主要与葡萄球菌科（Staphylococcaceae）的细菌相关。在不同蜱种中，寄生和自由生活蜱虫的微生物组成存在显著差异。随机森林分析进一步证实，蜱种和动物宿主对微生物组组成的影响最大。其中，立克次体（Rickettsia）对多种环境和生物因素表现出动态响应，而立克次体（Rickettsia）和弗朗西斯菌（Francisella）都超过60%，表明它们的分布模式受到环境变量的强烈影响。

蜱虫微生物组高度复杂，主要包括环境细菌和蜱相关细菌。后者通常包括立克次体（Rickettsia）、考克斯体（Coxiella）、无形体（Anaplasma）、埃里希体（Ehrlichia）、弗朗西斯菌（Francisella）和疏螺旋体（Borrelia）等属的物种。为了探索这种复杂性，从1,373个rMAGs中提取了注释为这六个属的基因组，并识别出11个立克次体物种（包含582个MAGs）、26个考克斯体物种（624个MAGs）、11个无形体物种（95个MAGs）、8个埃里希体物种（30个MAGs）、3个弗朗西斯菌物种（89个MAGs）和3个疏螺旋体物种（5个MAGs）。通过将这些基因组与已知细菌进行比较，识别出6个立克次体物种（111个MAGs）、7个无形体物种（38个MAGs）、6个埃里希体物种（20个MAGs）和2个疏螺旋体物种（4个MAGs），所有这些先前均未被表征。虽然26个考克斯体物种中的24个和所有弗朗西斯菌物种最初被分类为未定义细菌，但基于当前对蜱传微生物的理解，将它们重新分类为类考克斯体内共生体（Coxiella-LE）和类弗朗西斯体内共生体（Francisella-LE）。

研究人员利用本研究获得的582个立克次体基因组以及参考序列数据库中所有149个立克次体基因组构建了系统发育树。本研究的MAGs属于四个已知立克次体群中的三个：斑疹热群（SFG）、过渡群和斑疹伤寒群。对于SFG中的MAGs，大多数被分类为一个物种，但系统发育树揭示了物种或亚种水平的显著多样性：森林革蜱（Dermacentor silvarum）、微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）和图兰扇头蜱（Rhipicephalus turanicus）携带SFG立克次体，全沟硬蜱（Ixodes persulcatus）携带祖先群立克次体，蒙哥马利血蜱（Haemaphysalis montgomeryi）主要携带斑疹伤寒群立克次体。除了组装四个已知无形体物种的基因组外，还获得了七个先前未描述的无形体物种的基因组。系统发育分析显示，三个未定义物种形成了一个与嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）密切相关的独特分支，后者是一种 notorious 的人类和动物病原体。对于埃里希体，研究人员组装了两个已知物种（米纳斯埃里希体 Ehrlichia minasensis 和鼠埃里希体 Ehrlichia muris）和六个未知埃里希体物种的基因组。三个先前未表征的物种，命名为 Candidatus Ehrlichia granulatus、Candidatus Ehrlichia microplus-1 和 Candidatus Ehrlichia javanensis，分别与埃里希体 sp. HF、犬埃里希体（Ehrlichia canis）和反刍动物埃里希体（Ehrlichia ruminantium）遗传上接近。这些先前未描述的物种的发现扩展了无形体科（Anaplasmataceae）蜱传病原体的基因组资源，并为蜱传病原体的早期预警提供了见解。

为了比较立克次体、无形体和埃里希体之间的基因组特征，基于蛋白质相似性识别了直系同源基因。值得注意的是，与无形体和埃里希体相比，立克次体拥有显著更多的独特基因。立克次体特异性基因特别富集在原核防御系统通路中，主要与I型R-M系统相关。对属特异性基因的直系同源群（COG）注释表明，与无形体和埃里希体相比，立克次体拥有更多参与细胞过程和信号传导的基因。此外，研究人员组装了三个疏螺旋体物种的基因组，并研究了蜱相关细菌在不同蜱种中的分布。

鉴于蜱虫是专性吸血节肢动物，依赖内共生体提供的维生素补充，研究人员筛选了聚类以识别类考克斯体内共生体（Coxiella-LE）、类弗朗西斯体内共生体（Francisella-LE）、 Arsenophonus 和 Candidatus Midichloria。Coxiella-LE 常见于血蜱属（Haemaphysalis）、革蜱属（Dermacentor）、硬蜱属（Ixodes）和某些软蜱中，尽管流行率不同。Francisella-LE 几乎普遍存在于花蜱属（Amblyomma）和璃眼蜱属（Hyalomma）物种中，并偶尔在长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）中检测到。此外，对立克次体内共生体的系统发育分析在两只波斯锐缘蜱（Argas persicus）和七只爪哇花蜱（Amblyomma javanense）中识别出它们。Coxiella-LE 基因组聚集成三个不同的进化枝，包括一个与贝氏考克斯体（Coxiella burnetii）在一起的进化枝。Coxiella-LE 的系统发育位置与蜱种或蜱属没有明显的相关性。立克次体内共生体显示某些毒力基因缺失。Francisella-LE 基因组聚集成一个单一的系统发育进化枝。值得注意的是，在分析的 Francisella-LE 基因组中，致病岛基因要么是假基因化，要么缺失。

这项研究为研究蜱虫中遗传-微生物组关联提供了全面资源。相关性分析揭示了线粒体基因组多样性与微生物群落相似性之间的显著相关性，特别是在来自中国中部的自由生活长角血蜱（H. longicornis）和寄生在内蒙古-新疆地区羊身上的森林革蜱（D. silvarum）中。这些发现激发了研究人员探索蜱虫遗传多态性与病原体丰度之间关系的好奇心。研究人员选择了三个具有足够样本量的蜱种进行微生物组全基因组关联研究（mGWAS）：长角血蜱（H. longicornis）、微小扇头蜱（R. microplus）和森林革蜱（D. silvarum）。在长角血蜱中检测到20,547个单核苷酸多态性（SNPs），在微小扇头蜱中检测到20,536个SNPs，在森林革蜱中检测到55,530个SNPs。使用贝叶斯信息和连锁不平衡迭代嵌套关键通路（BLINK）进行了识别的SNPs与病原体丰度之间的相关性分析。该分析揭示了长角血蜱和微小扇头蜱中19个与病原体显著相关的SNPs，森林革蜱中31个SNPs（P<10^-6）。

在评估核苷酸突变的潜在功能影响后，在长角血蜱中鉴定出4号染色体上一个编码肽酶M13家族蛋白的基因内的一个SNP。该SNP可能增强长角血蜱的吸血能力。另一个SNP位于长角血蜱基因组3号染色体上一个编码含RING型结构域蛋白的基因内，该基因参与泛素化过程。在微小扇头蜱中，在一个与5-羟色胺受体样蛋白基因相关的SNP被识别，该基因涉及吸血途径。在森林革蜱中，发现了一个与幼年激素酸甲基转移酶（JHAMT）相关的基因中的一个SNP。

为了确定SNPs是否在物种间共享相似功能，研究人员调查了SNPs是否在物种间共享相似功能。基因本体（GO）注释识别出三个物种中109个共享的GO术语，主要与发育、代谢、定位、细胞过程、繁殖和应激反应等生物过程相关。SNP纯合性与病原体丰度之间出现了显著的关系，纯合子蜱虫通常表现出更高的病原体负荷。基于SNP纯合性的聚类区分了不同的样本组。在长角血蜱中，聚类形成与采样地点或寄生状态没有显著相关性，而在森林革蜱中，聚类与采样地点、寄生宿主和寄生状态显著相关。这些发现表明，区域和环境因素影响森林革蜱的基因型聚类，可能影响其微生物群落变异。

本研究构建了一个全面的宏基因组数据库，包含来自八属48种蜱虫的超过16,000只成年蜱虫，代表了不同的生态环境、地理区域和吸血状态，包含了46种其微生物组从未基于宏基因组测序进行过分析的蜱种。对优势蜱种的广泛和扩展采样使我们能够揭示微生物组成与生态地理因素、宿主关联和蜱虫关键生物学特性之间的关联。

数据库中约三分之二的基因组属于先前未表征的细菌物种，突显了蜱虫微生物组巨大且出乎意料的多样性。先前关于蜱虫微生物组的研究使用了基于扩增子的方法，靶向高度保守的16S核糖体RNA区域，但不足以检测未定义的细菌。在之前的工作中，对中国蜱虫中的潜在病原体进行了初步调查，为了解其媒介能力提供了更深入的见解。在本研究中，利用宏基因组测序和从头组装，能够识别已知和未知的细菌物种，并提供关于蜱虫微生物组的更全面视角。

在许多情况下，人类感染仅在发现此类潜在病原体数年后才被确认，部分原因是人类血液中的微生物负荷显著低于蜱虫。例如，西伯利亚立克次体西伯利亚亚种BJ-90于1990年首次在中国草原革蜱（Dermacentor nuttalli）中检测到，但直到22年后才被确认为人类病原体。类似地，本研究中19个先前未描述的蜱相关细菌物种代表了潜在的人类病原体，强调了加强监测以早期识别和预防新发蜱传疾病的迫切需求。

在长角血蜱中，两个位点显示出显著的基因型依赖性调控，纯合子个体表现出明显高于杂合子对照的立克次体负荷。3号染色体上的SNP可能通过调节RING型泛素连接酶基因的表达或酶活性来影响泛素化途径，从而调节蜱虫免疫反应。这种机制可能改变立克次体逃避蜱虫免疫系统的能力，最终影响病原体负荷。研究表明，泛素连接酶限制了立克次体 bacterium 嗜吞噬细胞无形体（A. phagocytophilum）在肩板硬蜱（Ixodes scapularis）中的定植，它们的沉默赋予这种立克次体 bacterium 生存优势。4号染色体上肽酶家族M13基因的突变可能调节蜱虫血管功能，可能诱导血管通透性异常，破坏组织微环境稳态，从而影响蜱虫内立克次体的定植效率。在微小扇头蜱中，5-HT受体基因的遗传变异显示与立克次体负荷显著相关。先前的研究表明，血清素生物合成调节蜱虫的吸血效率，表明5-HT介导的神经信号可能通过关键表型（如吸血性）调节病原体负荷。森林革蜱中JHAMT基因突变可能通过影响幼年激素生物合成和随后的发育过程来调节无形体传播。

总体而言，研究人员建立了一个全面的大规模细菌基因组数据库，证明了生态地理对微生物组成的影响，识别了多样化的具有致病潜力的蜱相关细菌物种，并揭示了蜱基因组多样性与病原体丰度之间的显著关联。对蜱虫、微生物组和病原体之间复杂相互作的调查增强了我们对蜱传疾病的理解，并为制定有针对性的蜱虫控制策略提供了宝贵的见解。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术方法：从中国31个省区市采集48种蜱虫样本，进行形态学鉴定和分组；使用Illumina和Nanopore双平台进行全基因组和宏基因组测序；通过生物信息学流程进行宿主基因组和微生物基因组的从头组装与质量控制；利用系统发育分析和多样性指数评估微生物群落结构；采用微生物组全基因组关联分析（mGWAS）挖掘宿主遗传变异与微生物表型的关联。