综述：机器学习技术对生物医学、食品和环境分析中电化学、光学及图像分析方法发展的影响

本综述系统探讨了机器学习（ML）技术在电化学、光学及图像分析方法中的融合应用，重点展示了基于AgNPs@Co(II)MOFs@PtNPs复合材料的无标记电化学免疫传感器在狂犬病毒（RV）抗体检测中的突破，其检测限达4.508×10?10 mol/L，为生物标志物检测提供了高灵敏度、低成本的新策略。

　　

Abstract

高效诊断方法对评估未暴露人群及疫苗接种者的抗体水平具有重要价值。本研究开发了一种基于AgNPs@Co(II)MOFs@PtNPs复合材料的无标记电化学免疫传感器，用于快速检测狂犬病毒（RV）抗体。通过基因工程技术制备RV核蛋白（NP）抗原及其纳米抗体作为试剂材料，采用混合溶剂热法合成以钴基金属有机框架（Co-MOFs）为基底的双金属复合材料，并沉积于玻碳电极表面。RV-NP抗原共价固定于Co-MOF表面，通过与RV抗体的特异性结合引起电流变化，实现传感检测。该传感器在差分脉冲伏安法（DPV）中呈现7.576×10^?11 mol/L至3.788×10^?5 mol/L的线性检测范围，相关系数（R²）为0.9965，检测限为4.508×10^?10 mol/L。该传感器具备优异的重复性、稳定性、特异性及临床适用性，为RV抗体早期筛查提供了一种精准、经济的工具。

Introduction

狂犬病是由狂犬病毒（RV）引起的致命性人畜共患脑炎，症状出现后死亡率接近100%。近年来，狂犬病持续位居中国法定传染病死亡之首。疫苗接种是防控狂犬病的关键手段，而高效评估抗体水平的诊断方法对未暴露人群及疫苗接种者具有重要意义。当前RV抗体检测主要依赖荧光抗体技术与ELISA法。前者虽灵敏度高、特异性强，但受样本基质效应和操作经验限制；后者适用于大规模筛查，但灵敏度有限且需多次洗涤步骤。因此，开发高效、准确、便捷的RV抗体检测新技术需求迫切。

纳米抗体（~15 kDa）相较于单克隆抗体具有分子量小、灵敏度高、稳定性强、成本低及易于工程化修饰等优势，成为快速现场免疫检测的新兴材料。近年来，生物传感器在传染病诊断中展现出巨大潜力，通过整合生物识别元件（如抗体、适体）与信号转导技术，可实现病毒抗原或抗体的高灵敏、高特异性检测。基于电化学、光学或压电原理的生物传感器可在短时间内完成定量分析，适用于现场快速筛查。然而，狂犬病检测生物传感器仍面临检测范围窄、复杂生物样本（如唾液、脑组织、血清）基质干扰等挑战，限制其现场应用。

RV免疫诊断主要靶向核蛋白（NP）抗原。NP虽诱导非保护性抗体，但其高表达水平和结构保守性使其成为亚型诊断的关键靶标。目前针对狂犬病NP的电化学检测方法仍较为稀缺。金属有机框架（MOFs）是由无机金属节点与有机配体通过配位键自组装形成的三维多孔晶体材料，具有大比表面积、可调孔径和化学可修饰性，在催化、传感及生物医学应用中前景广阔。Co(II)@MOFs凭借优异的结构稳定性和电化学活性，成为构建传感界面的理想载体。

针对上述问题，本研究设计了一种双金属复合MOF材料（AgNPs@Co(II)MOFs@PtNPs）。银纳米颗粒（AgNPs）和铂纳米颗粒（PtNPs）的引入协同增强了材料导电性与催化活性，显著提高了抗原-抗体结合界面的电子传输效率。本研究利用制备的RV-NP抗原作为识别元件，构建了基于AgNPs@Co(II)MOFs@PtNPs修饰玻碳电极的电化学生物传感器，通过优化MOF复合材料表面界面性质，实现了对RV-NP抗体的高灵敏检测，为未暴露人群及疫苗接种者的抗体水平评估提供了新方法，同时为复杂样本中低丰度生物标志物的检测开辟了新途径。

Materials and reagents

实验所用氯铂酸（H₂PtCl₆）、七水合硫酸钴（CoSO₄·7H₂O）、柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、2-氨基-1,4-苯二甲酸（NH₂-H₂BDC）、硝酸银（AgNO₃）等试剂均购自专业供应商，纯度不低于99%。所有化学试剂均直接使用，未经进一步纯化。

Preparation and identification of RV-NP antigen

通过IPTG诱导阳性转化子pET28a-RV-NP-BL21(DE3)表达RV NP重组蛋白，经超声破碎细胞后，采用镍柱-AKTA纯化系统从 supernatant 中纯化目标蛋白。SDS-PAGE分析显示，250 mM咪唑洗脱获得分子量约67 kDa的高纯度蛋白。Western blot验证表明，纯化后的重组蛋白可成功与RV抗体结合，证实其具备良好的免疫反应性。

Conclusion

本研究采用混合溶剂热法合成了AgNPs@Co(II)MOFs@PtNPs复合材料，其稳定性与导电性显著提升，活性位点丰富，可放大电化学信号，从而提高对狂犬病毒抗体检测的灵敏度并拓宽线性范围。传感器线性检测范围达4.508×10^?11至3.788×10^?5 mol/L，检测限为4.508×10^?10 mol/L，具备卓越的重复性、稳定性、特异性及临床适用性，为狂犬病抗体筛查提供了可靠平台。