DNTαβ细胞移植在调节脊髓损伤小鼠免疫微环境中的神经保护作用

《Neurotherapeutics》：Neuroprotective role of DNTαβ Cell transplantation on modulating immune microenvironment in spinal cord injured mice

脊髓损伤后DNTαβ细胞移植通过调节免疫微环境促进神经再生。研究采用流式细胞术分离DNTαβ细胞并经尾静脉或局部注射，结合单细胞转录组和免疫组化分析，发现DNTαβ细胞能抑制胶质细胞增殖（GFAP减少）、促进神经元存活和髓鞘形成（NeuN和MBP表达增加）。转录组测序揭示其通过激活Ifn信号通路（Ifit1/3/7 upregulation）和Gzmb介导的免疫调节机制（抑制Th1极化、减少促炎因子分泌）。行为学评估显示移植组BMS评分提升，步态分析和家笼行为测试证实运动功能显著恢复。本研究为SCI治疗提供了新策略，证实DNTαβ细胞在免疫调节和神经修复中的双重作用。

　　脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）是一种严重影响人类健康的疾病，其特征在于脊髓结构和功能的破坏，导致运动、感觉以及自主神经系统的障碍。由于SCI的发生通常伴随着复杂的病理生理过程，包括初级损伤和次级损伤，次级损伤常常是影响神经再生和功能恢复的关键因素。在次级损伤阶段，炎症反应和免疫环境的改变成为导致神经细胞死亡和组织修复困难的重要原因。因此，调节次级免疫反应，改善脊髓微环境，成为当前SCI治疗研究的重要方向。

近年来，免疫系统在SCI中的作用逐渐受到关注，尤其是CD3⁺CD4^?CD8^?双阴性T细胞（Double-negative T cells, DNTs）因其在免疫调节中的多样性功能而备受瞩目。这些细胞不仅在免疫应答中具有调节作用，还可能在神经修复过程中发挥重要作用。流式细胞术数据显示，SCI后DNT细胞的比例显著上升，提示其在损伤后免疫环境中的活跃性。进一步的单细胞测序分析则揭示了DNT细胞的异质性，其中CD3⁺TCRαβ⁺CD4^?CD8^?NK1.1^? T细胞（DNTαβ）可能具有免疫调节功能，从而为SCI的治疗提供了新的思路。

本研究旨在探讨DNTαβ细胞在SCI治疗中的潜在作用和机制。我们首先通过流式细胞术从小鼠的脾脏和淋巴结中分离出DNTαβ细胞，并通过局部注射和尾静脉注射两种方式将其移植到SCI模型小鼠体内。实验结果显示，无论是直接注射到损伤部位还是通过尾静脉进行全身性输注，DNTαβ细胞均显著促进了小鼠的运动功能恢复。具体而言，BMS评分、开放场测试、抓力分析以及步态分析均表明，DNTαβ细胞治疗组在多个方面表现出优于对照组的恢复效果。

在组织学分析方面，我们通过免疫组化方法观察到，DNTαβ细胞能够抑制胶质细胞的增殖，并促进神经元的存活和髓鞘形成。这些发现进一步支持了DNTαβ细胞在调节免疫微环境中的关键作用。此外，转录组测序数据揭示了DNTαβ细胞在SCI后的免疫调控机制，包括通过Gzmb和IFN信号通路来调节免疫反应，从而促进早期修复和神经保护。这些结果表明，DNTαβ细胞不仅在免疫调节方面具有重要影响，还可能通过其分子机制促进神经再生。

为了进一步理解DNTαβ细胞在SCI中的作用机制，我们进行了单细胞RNA测序分析，以探索不同时间点DNTαβ细胞的基因表达特征。结果显示，DNTαβ细胞在SCI后3天、7天和14天表现出不同的基因表达模式。在早期阶段，与神经突触功能和神经信号传导相关的基因显著上调，这表明DNTαβ细胞可能在早期促进神经元的稳定和突触修复。在中期，与T细胞激活和神经投影相关的基因表达增加，提示DNTαβ细胞在调节免疫反应和神经修复过程中发挥了重要作用。在后期，与细胞外基质组织、轴突投射以及离子通道活性相关的基因显著上调，表明DNTαβ细胞可能在组织重塑和再生过程中发挥了关键作用。

这些阶段性基因表达的变化表明，DNTαβ细胞在SCI治疗中具有时间依赖性的调节功能。它们可能通过不同的分子机制，在脊髓损伤的不同阶段发挥不同的作用。例如，在早期，DNTαβ细胞可能通过促进神经元的稳定和突触的修复来支持神经功能的恢复；在中期，它们可能通过调节T细胞的激活和分化，从而抑制过度的炎症反应；在后期，它们可能通过促进细胞外基质的组织和轴突的再生，帮助脊髓组织的修复和功能恢复。

此外，研究还发现DNTαβ细胞在体内丰度较低，直接从脾脏和淋巴结中分离并用于SCI治疗的效率有限。因此，我们采用体外诱导的方法来扩增DNTαβ细胞，通过共培养未成熟CD4⁺ T细胞与成熟树突状细胞，并加入IL-2，成功获得了大量DNTαβ细胞。这一方法不仅提高了细胞的产量，还为后续的治疗实验提供了充足的细胞来源。通过体外扩增的DNTαβ细胞进行治疗，同样取得了显著的神经功能恢复效果，表明这种细胞在SCI治疗中的应用具有广阔的前景。

在临床转化方面，局部注射虽然能够提高DNTαβ细胞的局部浓度，但可能带来二次损伤和感染等风险，限制了其在临床中的应用。相比之下，尾静脉注射作为一种更安全的途径，能够减少对局部组织的直接损伤，同时通过血液循环将细胞输送到损伤部位。尽管系统性输注可能影响细胞向损伤部位的归巢效率，但实验结果表明，尾静脉注射的DNTαβ细胞仍然能够有效地迁移到损伤部位，并发挥其免疫调节和神经保护作用。因此，尾静脉注射可能成为未来临床应用的一种可行方式。

综上所述，本研究通过多种实验方法，揭示了DNTαβ细胞在SCI治疗中的重要性。这些细胞不仅能够通过免疫调节机制改善脊髓微环境，还可能通过促进神经元的存活和髓鞘形成，支持神经功能的恢复。研究结果表明，DNTαβ细胞的移植可以有效促进SCI小鼠的运动功能恢复，并且在体外扩增后，其治疗效果并未减弱。这些发现为SCI的细胞治疗提供了新的策略和数据支持，也为未来开发更有效的治疗方案奠定了基础。

在未来的临床研究中，如何提高DNTαβ细胞的归巢效率、优化其治疗效果，以及探索其与其他治疗手段的联合应用，将是重要的研究方向。此外，进一步研究DNTαβ细胞在不同阶段的具体作用机制，如其如何通过调控CTLA-4、IFIT家族基因以及Gzmb等关键分子来影响免疫微环境和神经修复，也将有助于更深入地理解其在SCI治疗中的作用。通过这些研究，我们有望开发出更加精准和有效的细胞治疗策略，为SCI患者带来新的希望。