Ninjurin-1（NINJ1）介导甲型流感病毒感染中PANoptosis的细胞裂解与有害炎症反应

本刊推荐：为解决甲型流感病毒（IAV）感染引发的过度炎症与细胞死亡机制不明的问题，研究人员聚焦于膜蛋白NINJ1在PANoptosis（一种同时包含焦亡、凋亡和坏死性凋亡的细胞死亡形式）中的作用。研究发现，IAV感染上调NINJ1表达并诱导其寡聚化，进而介导细胞膜破裂（PMR）及损伤相关分子模式（DAMPs）和IL-1β的释放，但不影响细胞死亡进程。敲除NINJ1可减轻小鼠肺部损伤并降低死亡率。此外，在COVID-19患者中，NINJ1上调与不良预后相关。该研究揭示了NINJ1在病毒性肺炎免疫病理中的关键作用，为其作为治疗靶点和疾病严重程度生物标志物提供了依据。

　　

当甲型流感病毒（Influenza A Virus, IAV）入侵人体，它不仅能引发季节性流行，还可能导致严重的肺炎甚至死亡。其致命性并非完全源于病毒本身的直接破坏，而更多是由过度激活的免疫反应和不受控制的炎症风暴所导致。在感染过程中，一种名为PANoptosis的特殊细胞死亡形式被激活，它同时兼具焦亡（pyroptosis）、凋亡（apoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis）的特征。这种剧烈的细胞死亡会破裂细胞膜，释放大量损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs）和炎症因子，从而加剧组织损伤。尽管科学家们已知MLKL和GSDMD等分子是细胞裂解的关键执行者，但针对这些靶点的干预效果并不理想，且无法完全阻止炎症风暴。因此，寻找新的关键介质并阐明其机制，对于开发病毒性肺炎的有效治疗策略至关重要。

近期，一项发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》的研究将目光投向了膜蛋白Ninjurin-1（NINJ1）。NINJ1是近年来被发现的细胞膜破裂（Plasma Membrane Rupture, PMR）介质，但其在不同细胞死亡类型中的作用存在争议，在IAV感染引发的PANoptosis中的功能更属未知。为了回答NINJ1是否以及如何参与IAV引起的细胞死亡和免疫病理过程，研究人员开展了一系列深入的体外和体内实验。

本研究主要采用了以下关键技术方法：1）利用CRISPR-Cas9技术构建了NINJ1及其他相关基因（如ZBP1、GSDMD、GSDME、MLKL等）敲除的细胞系（包括BMDMs、iBMDMs、THP-1和A549细胞）和小鼠模型，用于功能缺失研究；2）通过蛋白质免疫印迹（Immunoblot）、BS³交联实验（Crosslinking assays）和银染（Silver staining）等技术检测蛋白质表达、寡聚化及释放；3）使用乳酸脱氢酶（LDH）释放实验、细胞活力检测和碘化丙啶（PI）染色等方法评估细胞死亡和膜完整性；4）通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量细胞上清液或小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞因子（如IL-1β、TNF-α、HMGB1）和总蛋白水平；5）借助单细胞RNA测序（scRNA-seq）和RNA-seq技术分析小鼠肺部组织、人COVID-19患者BALF样本及体外感染模型中的基因表达谱；6）对感染IAV的小鼠进行生存分析、肺部病理学评分（H&E染色）和病毒滴度（空斑试验）测定；7）利用流式细胞术（Flow cytometry）分析小鼠BALF和肺部组织中的免疫细胞亚群。

NINJ1 is upregulated upon IAV infection

研究人员首先发现，IAV感染后，小鼠肺部和小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中Ninj1的转录水平显著上调，且致死剂量感染比非致死剂量诱导的表达更高。通过分析单细胞RNA测序数据，他们证实Ninj1主要在髓系细胞（MYEs），特别是中性粒细胞（NEUs）和巨噬细胞（MAs）中高表达，而上调模式与炎症及PANoptosis相关基因（如Il1b, Zbp1, Gsdmd）相似，提示其可能与疾病严重程度和巨噬细胞PANoptosis相关。

Oligomerization of NINJ1 synchronizes with PANoptosis during IAV infection

进一步研究表明，在IAV感染的BMDMs中，NINJ1蛋白在感染后12小时发生寡聚化，与此同时，PANoptosis的三个核心通路（焦亡、凋亡和坏死性凋亡）也被激活，表现为GSDMD和GSDME的切割、Caspase-3/-7/-8的活化以及MLKL的磷酸化。细胞膜破裂的指标（LDH释放、PI⁺细胞比例增加）和炎症因子（如IL-1β、TNF-α）及DAMP（HMGB1）的释放也同步发生。这表明NINJ1寡聚化与PANoptosis的发生高度同步。

NINJ1 mediates IAV-induced cell lysis along with the release of DAMPs and IL-1β without compromising cell death

为了阐明NINJ1的功能，研究人员比较了野生型（WT）和Ninj1^-/- BMDMs。结果显示，NINJ1缺失或突变其寡聚化关键残基（K45Q）后，细胞膜破裂和细胞内内容物（LDH、HMGB1）的释放被显著抑制，感染的细胞维持膨胀的球状形态而不破裂。然而，NINJ1的缺失并未挽救细胞死亡。意外的是，IL-1β的释放也减少了，但这并非由于转录水平的变化，且与GSDMD缺失的表型不同（GSDMD缺失不影响IL-1β释放）。这种作用不具有病毒株特异性。使用甘氨酸（glycine）抑制NINJ1寡聚化，也能重现上述表型，且其作用依赖于NINJ1。

NINJ1-mediated cell lysis is completely dependent on ZBP1 during IAV infection

IAV诱导的PANoptosis依赖于I型干扰素（IFN）和ZBP1。本研究发现，Zbp1^-/- 或 Ifnar1^-/- BMDMs中，细胞死亡、细胞膜破裂、所有程序性细胞死亡通路的激活以及NINJ1寡聚化均被完全抑制。NINJ1缺失和ZBP1缺失在抑制LDH释放方面效果相当，但只有ZBP1缺失能挽救细胞死亡并更彻底地抑制IL-1β释放。这表明NINJ1介导的细胞裂解完全依赖于ZBP1，但NINJ1与ZBP1在调控细胞存活和炎症反应方面功能不同。

NINJ1 oligomerization is not regulated by the NLRP3 inflammasome

NLRP3炎症小体是IAV感染中的重要传感器，但本研究发现在BMDMs中，敲除Nlrp3或Casp1并不影响IAV诱导的裂解性细胞死亡、NINJ1寡聚化或其他PANoptosis通路（如GSDMD活化）的激活，仅部分减少了IL-1β的释放。这表明NLRP3炎症小体对IAV诱导的巨噬细胞PANoptosis和NINJ1寡聚化的调控作用有限。

Activation of any cell death pathway in IAV-induced PANoptosis is sufficient to induce NINJ1 oligomerization

接下来，研究人员探究了NINJ1与其他孔道形成执行蛋白（GSDMD, GSDME, MLKL）的关系。单独敲除Gsdmd、Gsdme或Mlkl，甚至三敲除（Gsdmd^-/-Gsdme^-/-Mlkl^-/-），均未能阻止细胞裂解和NINJ1寡聚化。只有在三敲除细胞中使用广谱 caspase 抑制剂Z-VAD-FMK同时抑制凋亡通路，才能完全阻断所有细胞死亡通路、NINJ1寡聚化和细胞裂解。使用Caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK也能部分抑制。相反，在WT或Gsdmd^-/-Gsdme^-/-细胞中，Z-VAD-FMK处理反而增强了由MLKL介导的坏死性凋亡所驱动的NINJ1寡聚化和LDH释放，且甘氨酸处理可部分抑制此过程。这些结果表明，在IAV诱导的PANoptosis中，三条细胞死亡通路中的任何一条被激活，都足以触发NINJ1寡聚化和剧烈的细胞裂解。即使是传统的“静默”的凋亡通路，单独激活时也能通过NINJ1引起炎症性的细胞裂解。

NINJ1 functions poorly in IAV-infected alveolar epithelial cells

与巨噬细胞不同，肺泡上皮细胞（AECs）中NINJ1的基础表达较低。在IAV感染的A549细胞（人肺泡上皮细胞系）中，敲除NINJ1并不影响细胞活力、细胞裂解（LDH释放）或病毒滴度，而敲除GSDME则具有保护作用。甘氨酸处理也无效果。这表明NINJ1在IAV感染的肺泡上皮细胞中作用甚微，其功能具有细胞类型特异性。

NINJ1 drives IAV-induced lung pathology and excessive inflammation

在体内实验中，与Zbp1^-/-、Gsdmd^-/-、Gsdme^-/- 或 Mlkl^-/- 小鼠不同，Ninj1^-/- 小鼠在经受致死剂量IAV攻击后生存率显著提高。其肺部病理损伤减轻，BALF中的总蛋白、HMGB1水平以及促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）浓度显著降低，但这并非由于病毒载量的变化。免疫细胞分析显示，早期（3 dpi）的炎症反应正常，保证了抗病毒 immunity，但后期（6 dpi）Ly6C⁺ 单核细胞等致病性免疫细胞浸润减少。I型干扰素反应和抗病毒CD8⁺ T细胞反应未受影响。此外，上皮屏障完整性得到改善。值得注意的是，额外敲除Il1b会削弱Ninj1缺失带来的保护作用，表明IL-1β在宿主防御中仍不可或缺，NINJ1仅部分抑制其释放达到了最佳平衡。

NINJ1 is a potential bioindicator of hyperinflammation and poor outcome in patients with severe viral pneumonia

最后，研究人员将研究延伸至临床。通过对COVID-19患者BALF样本和已发表肺部样本的单细胞数据进行分析，发现与健康对照组相比，重症/危重症COVID-19患者中NINJ1表达显著上调，特别是在单核细胞/巨噬细胞（Mo/Ma）中，并且其表达在死亡患者中最高。NINJ1的表达与炎症反应呈正相关，但与抗病毒反应关联不大。这提示Mo/Ma中的NINJ1表达水平可能作为病毒性肺炎过度炎症状态和不良预后的潜在生物标志物。

结论与意义

本研究系统性地揭示了NINJ1在IAV感染免疫病理中的核心作用。其机制在于，IAV感染通过ZBP1依赖性方式上调NINJ1表达，并激活PANoptosis中的任一通路（包括凋亡通路）来触发NINJ1寡聚化，进而介导细胞膜破裂、DAMPs释放和部分IL-1β释放，最终驱动有害的炎症反应和组织损伤。敲除NINJ1可在不影响抗病毒免疫的前提下，特异性抑制细胞裂解和过度炎症，从而改善疾病结局。

该研究的重大意义在于：首先，它明确了NINJ1是连接多种细胞死亡通路与最终细胞裂解的一个共同且关键的节点。其次，它挑战了传统认知，揭示了即使单独的凋亡通路激活，在IAV感染背景下也能通过NINJ1导致炎症性细胞死亡，而非免疫静默。第三，研究提出了靶向NINJ1（例如使用其抑制剂如甘氨酸或拮抗性抗体）作为一种新的治疗策略，旨在精确遏制细胞裂解和DAMP释放，从而避免炎症风暴，同时保留必要的细胞死亡和抗病毒 immunity，为治疗流感、COVID-19等病毒性肺炎及病毒性脓毒症提供了新的思路和潜在靶点。最后，发现NINJ1的表达水平与疾病严重程度和预后相关，使其有望成为一个有价值的生物标志物。

未来的研究值得在其他病毒感染和其他细胞类型（如中性粒细胞）中进一步探索NINJ1的功能，并推动靶向NINJ1的 therapeutics 的开发。