蓝激光激活纳米载体递送小檗碱增强光动力疗法靶向抑制变形链球菌生物膜与gtfB基因表达的离体研究

本研究针对变形链球菌(S. mutans)生物膜介导的龋病难题，开发了蓝激光(405±10 nm)激活的载小檗碱纳米脂质体(nNios@Ber)新型光动力疗法(PDT)。研究发现该疗法可显著降低生物膜活性达3.5 log10 CFU/mL，并剂量依赖性下调毒力基因gtfB表达7.4倍，其效果与0.2%氯己定相当，为龋病防治提供了无创、靶向的新型治疗策略。

　　

在口腔健康领域，龋病始终是一个全球性的健康挑战。这种由细菌生物膜引起的疾病，不仅会导致牙齿结构的破坏，还可能引发一系列全身性健康问题。在众多口腔微生物中，变形链球菌(Streptococcus mutans)被认为是龋病发生发展的关键致病菌。它通过产生葡萄糖基转移酶(Gtfs)，特别是由gtfB基因编码的酶，合成细胞外多糖，形成坚固的生物膜基质，帮助细菌粘附在牙釉质表面并抵抗宿主防御机制和抗菌药物。

目前临床上主要采用机械清除结合化学抗菌剂的方法来管理龋病，其中氯己定(CHX)是最常用的辅助抗菌剂。然而，其防龋效果存在争议，且长期使用可能导致牙齿着色、味觉改变等副作用。这些局限性促使研究人员寻找替代疗法，光动力疗法(PDT)因此受到关注。

PDT具有非侵入性、对周围组织损伤小、不易引起微生物耐药性等优势。该疗法通过特定波长的光激活光敏剂，在分子氧存在下产生细胞毒性活性氧(ROS)，从而靶向杀灭微生物细胞。小檗碱(Berberine)作为一种从Berberidaceae植物中提取的天然异喹啉生物碱，因其显著的抗菌、抗炎和抗氧化特性，近年来作为PDT光敏剂受到越来越多的关注。它能够吸收344-422 nm波长范围的光，在418 nm处有最大吸收峰，光活化后能产生单线态氧(1O?)、超氧阴离子(O?•?)、过氧化氢(H?O?)、羟基自由基(•OH)和过氧自由基(ROO•)等多种ROS。

然而，小檗碱的水溶性差、口服生物利用度低、细胞渗透性有限和快速代谢降解等缺点限制了其临床应用。为了克服这些挑战，研究人员提出了基于纳米载体的递送系统，如纳米脂质体(niosomes)。纳米脂质体是由非离子表面活性剂组成的囊泡，能够包封亲水性和疏水性药物，其生物相容性、可生物降解性以及提高包封药物溶解度、稳定性和生物利用度的能力，使其成为有前景的靶向药物递送载体。

在这项发表在《Photodiagnosis and Photodynamic Therapy》的研究中，Tehran University of Medical Sciences的研究团队开发了一种蓝激光激活的载小檗碱纳米脂质体(nNios@Ber)，并评估了其通过PDT对抗牙釉质上S. mutans生物膜的功效。这项研究探索了结合纳米载体递送和光动力激活以增强小檗碱在龋病预防和管理中治疗效果的潜力。

研究人员采用薄膜水化法制备nNios@Ber，并通过透射电镜(TEM)对其形态进行表征。使用离心法测定小檗碱的包封率(EE%)，并建立标准曲线进行计算。研究使用人牙釉质块离体培养S. mutans生物膜，按照临床和实验室标准协会(CLSI)指南测定nNios@Ber对S. mutans的最低抑菌浓度(MIC)。将25个釉质块随机分为5组：nNios@Ber组、蓝激光组、PDT(nNios@Ber+蓝激光)组、阳性对照(0.2% CHX)组和阴性对照(生理盐水)组。通过菌落形成单位(CFU)测定评估抗生物膜活性，并采用定量实时PCR(qRT-PCR)分析gtfB基因表达。

研究结果显示，TEM分析证实nNios@Ber呈近似球形，平均直径小于100纳米。小檗碱在nNios@Ber制剂中的包封率达到67.65%。nNios@Ber对S. mutans的MIC为15.6 μg/mL。抗生物膜活性实验表明，不同浓度的nNios@Ber(2×MIC、4×MIC和8×MIC)处理可剂量依赖性地减少生物膜形成。PDT组显示出最大的生物膜减少效果，其中8×MIC+蓝激光组的减少量最高(3.50±0.12 log₁₀)，其次是4×MIC+蓝激光组(3.10±0.10 log₁₀)和2×MIC+蓝激光组(2.68±0.07 log₁₀)。相比之下，单独蓝激光组仅实现最小生物膜减少(0.016±0.08 log₁₀)，无统计学意义。值得注意的是，8×MIC+蓝激光PDT组的微生物生物膜减少与0.2% CHX组无显著差异。

在基因表达方面，qRT-PCR分析证明所有PDT治疗组均显著下调gtfB基因表达。随着nNios@Ber浓度增加并结合蓝激光照射，gtfB表达呈剂量依赖性减少，2×MIC、4×MIC和8×MIC+蓝激光组分别观察到4.8、5.7和7.4倍的变化。0.2% CHX处理导致gtfB表达下降7.2倍。相反，单独使用nNios@Ber或蓝激光均未产生gtfB表达的统计学显著变化。

研究结论表明，蓝激光激活的nNios@Ber能显著抑制S. mutans生物膜形成和毒力基因表达，为龋病管理提供了一种有效且靶向的方法。这种光激活的nNios@Ber增强了光动力活性，为传统抗菌剂(如CHX)在口腔保健中的应用提供了有前景的辅助或替代方案。

讨论部分强调，这是首项研究小檗碱作为光敏剂负载于纳米脂质体(nNios@Ber)中，通过PDT对抗牙釉质表面形成的S. mutans生物膜的抗菌效果。相对较低的MIC值表明nNios@Ber具有强效抗菌活性，这可能归因于纳米脂质体载体系统包封小檗碱后的增强递送和持续释放特性。选择蓝光(405±10 nm)是因为其被小檗碱最佳吸收，有助于高效产生ROS用于抗菌PDT。在离体模型中，S. mutans生物膜通常厚20-100 μm，完全在405 nm蓝光有效穿透深度(约50-200 μm)范围内，确保nNios@Ber在表层靶向激活。

剂量依赖性的生物膜减少(8×MIC激光激活后最多减少3.5 log₁₀ CFU/mL)突显了nNios@Ber和蓝激光的协同效应。PDT(8×MIC nNios@Ber+蓝激光)的抗生物膜效果与0.2% CHX相当，表明其作为化学抗菌剂非侵入性替代品的潜力。值得注意的是，单独使用蓝激光(405±10 nm)和未激光激活的nNios@Ber对生物膜基因表达影响最小，强调了光激活对于实现治疗性光动力效应的必要性。

gtfB下调具有生理学意义，因为GtfB产生的水不溶性葡聚糖形成致龋生物膜的支架，增强细菌粘附、结构完整性和耐酸性。抑制gtfB表达可能减少细胞外基质形成，损害生物膜成熟，增加细菌对宿主防御和抗菌剂的敏感性。gtfB基因表达分析为了解PDT对毒力因子的亚致死效应和存活细菌的生物膜形成潜力提供了宝贵见解。这种剂量依赖性下调表明即使有些细菌在治疗后存活，其毒力也会降低，形成强大生物膜的能力受损。

重要的是，本研究使用的浸入人唾液中的釉质表面离体生物膜模型比体外浮游培养更能模拟临床条件，增加了研究结果的转化价值。研究结果支持nNios@Ber作为新型光敏剂平台的潜力，克服了游离小檗碱和化学抗菌剂的局限性。鉴于需要蓝激光，该PDT方案非常适合在牙科诊所专业应用，为管理龋病和增强口腔保健提供了靶向、微创的辅助或替代传统药物的方法。

这些发现为针对致龋生物膜的先进、微创抗菌策略铺平了道路，对改善口腔卫生保健具有重要意义。然而，还需要进一步的体内研究和长期临床试验来充分探索蓝激光激活nNios@Ber的安全性、功效和潜在宿主组织效应。此外，将这种方法与机械菌斑清除和预防策略相结合可能会最大化龋病管理的临床效果。未来的研究还应包括体内研究和对口腔角质形成细胞和成纤维细胞的细胞毒性测试，然后才能进行临床应用。