整合单细胞与bulk RNA测序揭示结直肠癌乙酰化分子特征及其免疫微环境调控机制

本文通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与加权基因共表达网络分析（WGCNA），系统解析了结直肠癌（CRC）中乙酰化修饰的细胞特异性分布及其与预后的关联。研究构建了基于10个乙酰化相关基因（ARPS）的机器学习预后模型，证实低风险患者免疫细胞浸润增强、免疫治疗响应更佳，为CRC的精准分型及免疫治疗策略提供了新型生物标志物和靶点。

　　

引言

结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其治疗面临肿瘤异质性和复杂微环境（TME）的挑战。近年来，乙酰化作为关键翻译后修饰，在调控基因表达、蛋白稳定性和细胞信号通路中发挥核心作用，尤其与肿瘤免疫微环境重塑密切相关。研究表明，乙酰化修饰通过影响肿瘤细胞与TME的相互作用，调节免疫应答并驱动癌症进展，可能成为免疫治疗响应的关键调控因子。

材料与方法

研究整合了来自GEO数据库的两个scRNA-seq数据集（GSE132465和GSE144735）及TCGA的bulk RNA-seq数据。通过Seurat包进行单细胞质量控制与细胞类型注释，利用Harmony算法消除批次效应。采用ssGSEA方法计算细胞乙酰化活性评分，并通过WGCNA识别乙酰化相关基因模块。基于机器学习算法（包括CoxBoost和RSF等101种组合）构建乙酰化相关预后特征（ARPS），并在独立队列（GSE39582）中验证其预测效能。进一步通过ESTIMATE、CIBERSORT和TIDE算法分析免疫微环境特征及免疫治疗响应潜力。

结果

单细胞转录组中的乙酰化特征

研究鉴定了9种细胞类型，包括上皮细胞、内皮细胞和基质细胞等。上皮细胞表现出最高的乙酰化活性评分，免疫细胞评分较低。通过差异表达分析筛选出1,815个乙酰化相关DEGs。

网络分析识别核心乙酰化模块

WGCNA鉴定出与乙酰化评分最相关的绿色模块（R=-0.75），包含169个基因。与bulk RNA-seq中的1,691个DEGs取交集后获得131个关键基因，这些基因显著富集于能量代谢、蛋白合成和膜运输等生物学过程。

机器学习整合乙酰化特征进行临床风险预测

通过LOOCV和10折交叉验证，确定CoxBoost+RSF组合为最优模型（C-index=0.781），构建包含10个基因（DCTPP1、TXNDC12、RPS24、TCEAL4、RAB5C、NME1、VOPP1、SMAGP、MRPL22、HINT1）的ARPS特征。高风险患者总生存期显著缩短（p<0.05），ROC曲线显示TCGA队列中1/3/5年AUC值分别达0.983、0.993和0.995。

ARPS的临床意义

高风险组中III/IV期患者比例显著升高（p<0.05），多因素Cox分析证实ARPS评分与TNM分期均为独立预后因素。

风险评分与肿瘤免疫微环境的关联

低风险组表现出更高的免疫评分、基质评分和估计评分，但肿瘤纯度较低（p<0.05）。CIBERSORT分析显示低风险组CD8⁺ T细胞、活化树突状细胞和滤泡辅助T细胞浸润增加，而高风险组M0和M2型巨噬细胞富集。ssGSEA进一步证实低风险组免疫细胞浸润和免疫功能通路激活更为显著。

ARPS在免疫治疗中的作用

低风险组免疫检查点（CTLA4、PD-L1、LAG3）表达显著上调（p<0.05），且肿瘤突变负荷（TMB）更高。TIDE评分分析表明低风险组免疫逃逸风险更低（p<0.05）。IPS评分验证低风险组对CTLA4/PD1抑制剂响应更佳。在IMvigor210免疫治疗队列中，低ARPS评分患者总生存期更长（p<0.01），治疗响应率更高。

药物治疗敏感性预测

低风险组对5-氟尿嘧啶、吉西他滨、硼替佐米等药物敏感性更高（IC50更低，p<0.05），而高风险组对Sepantronium bromide和Trametinib更敏感。

风险组间的生物学功能与通路分析

GSEA显示高风险组富集于MAPK信号通路、细胞周期和黏着斑通路，低风险组则显著富集于趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和肠道IgA免疫网络通路。

讨论

研究通过多组学整合分析揭示了乙酰化修饰在CRC中的空间异质性及其免疫调控作用。ARPS模型不仅提供可靠的预后预测工具，还为免疫治疗分层提供了新依据。关键基因如HINT1（肿瘤抑制因子）、RAB5C（EGFR内吞调控因子）和NME1（嘌呤代谢调节剂）可能通过乙酰化依赖的机制影响TME免疫状态。MAPK通路在高风险组的激活与免疫抑制表型相关，而低风险组的免疫活化特征与细胞因子通路激活密切相关。药物敏感性差异为临床个性化用药提供了理论依据。

结论

本研究系统阐明了CRC乙酰化修饰的细胞特异性分布规律及其临床意义，构建的ARPS模型在预后预测和免疫治疗响应评估中表现出优异性能。研究成果为开发靶向乙酰化通路的精准治疗策略提供了重要理论基础和转化价值。