保加利亚地区雨蛙种间形态变异研究：揭示东方雨蛙（Hyla orientalis）与树雨蛙（H. arborea）的形态分化与适应性进化

本研究针对遗传学已明确区分但形态鉴别特征匮乏的树雨蛙（Hyla arborea）与东方雨蛙（H. orientalis），在保加利亚六地采集196只成体样本，通过八项形态指标测量与图像相似性分析，首次系统比较了两物种的形态变异格局。研究发现虽然部分形态指数存在显著种间差异，但形态特征重叠度高，不支持作为野外物种鉴定的可靠依据。值得注意的是，遗传鉴定为东方雨蛙的Zaychino种群在形态上更接近树雨蛙，暗示局部环境适应或历史基因渗入可能主导形态变异。该研究为两近缘种的形态分化机制与杂交带研究提供了关键数据。

　　

在欧亚大陆的两栖动物研究中，树雨蛙（Hyla arborea）和东方雨蛙（Hyla orientalis）这一对姐妹种一直吸引着分类学家和进化生物学家的注意。尽管分子遗传学研究早已证实它们是独立的物种，但长期以来，科学家们却难以从外观形态上明确区分它们——这种“遗传上可分、形态上难辨”的现象，正是近缘种分化研究中典型的“形态保守性”难题。在保加利亚，这两个物种的分布区相邻甚至重叠，东方雨蛙广泛分布于该国大部分地区，而树雨蛙仅栖息于西南部的斯特鲁马河谷（Struma river basin）。这种分布格局为研究物种形成、适应性演化和潜在杂交现象提供了天然的实验场地。然而，缺乏系统的形态比较数据，不仅阻碍了野外调查中的物种准确鉴定，也限制了对二者生态位分化和进化机制的理解。

为了填补这一空白，由保加利亚科学院生物多样性与生态系统研究所的Simeon Lukanov领衔的研究团队，在《Zoologischer Anzeiger》上发表了一项细致入微的形态比较研究。他们于2021至2024年的繁殖季节，从保加利亚六个地点共采集了196只成年树蛙（144雄性和52雌性），其中三个地点位于树雨蛙的分布区，三个位于东方雨蛙的分布区。研究人员采用苯佐卡因（benzocaine）溶液对蛙类进行麻醉后，精确测量了包括体长（SVL）、大腿长（THL）、头长（HL）、头宽（HW）、眼径（ED）等八项形态指标，并计算了八种形态指数。此外，他们还对每只个体进行背侧和侧身摄影，利用Hotspotter软件分析侧条纹图案的相似性。对于分布存疑的Zaychino种群，更通过线粒体细胞色素b（cytb）基因测序进行物种鉴定。

研究采用的主要技术方法包括：基于形态测量数据的Mosimann法体型校正与对数转换、主成分分析（PCA）和判别分析（DA）用于多变量形态空间比较、方差分析（ANOVA）及事后检验评估种群间差异、基于Ward方法的聚类分析（CA）以及基于图像相似性算法的侧条纹模式量化比较。样本来源于保加利亚境内六个地理种群，涵盖两种物种的不同分布区。

研究结果揭示了一系列有趣的发现：

3.1. 形态测量比较

通过T检验发现，两物种在SVL及部分形态指数上存在显著差异。树雨蛙具有较大的体长，而东方雨蛙则具有较大的头长/体长（HL/SVL）和头宽/体长（HW/SVL）比值。在雄性中，树雨蛙还表现出较大的大腿长/体长（THL/SVL）和眼径/头长（ED/HL）比值，而东方雨蛙在眼-鼻孔距/头长（EN/HL）上比值更大。方差分析显示不同种群在多个指数上存在显著差异，特别是HW/SVL在两性中均呈现分化。主成分分析表明，斯特鲁马河谷的种群（树雨蛙）与Orsoya和Primorsko的种群（东方雨蛙）在形态空间上有部分分离的趋势，而Zaychino种群（遗传鉴定为东方雨蛙）的个体在形态上更接近树雨蛙种群。判别分析对两物种的正确分类率较高（雌性75-86%，雄性78-89%），但对Zaychino种群尤其是雄性的分类效果较差（正确率仅28.57%），再次表明该种群形态特征与遗传身份的错位。聚类分析将Orsoya种群单独聚为一支，其余种群（包括Zaychino）聚为另一支，暗示形态变异可能存在地理梯度。

3.2. 图像比较

侧条纹的相似性分析显示，绝大多数个体的最相似匹配均来自同一种群。Zaychino种群的图像相似性得分显著高于其他种群，但并未发现可靠的种间侧条纹形态差异。

在讨论中，作者指出该项研究首次系统提供了两物种在保加利亚地区的形态变异数据。虽然部分形态特征显示种间差异，但重叠度高，不支持作为野外鉴定的可靠标准。特别值得注意的是，Zaychino种群尽管线粒体DNA支持其为东方雨蛙，但其形态特征更接近树雨蛙，这可能反映了局部环境适应（该种群海拔较高）或历史基因渗入事件。作者推测该现象可能是由于杂交带向北延伸的结果，并建议未来采用核基因标记进一步验证。形态变异呈现南北和东西地理梯度，可能与微气候适应有关。与鸣声和遗传数据相比，形态特征在物种鉴别上的价值相对有限，但仍为理解种群分化和适应性进化提供了宝贵信息。

该研究的结论强调，树雨蛙与东方雨蛙在保加利亚的形态分化是细微且多变的，主要变异由地理种群差异所驱动，而非纯粹的种间分歧。虽然形态特征难以作为独立的物种鉴定标准，但本研究为理解这两个近缘种的形态进化、环境适应及潜在杂交现象提供了重要基础数据，尤其为澄清Zaychino区域的物种边界与进化历史提出了新的问题和研究方向。这些发现对两栖动物多样性保护及物种形成机制的研究均具有启示意义。