鱼类黏液采样与黏蛋白半定量方法比较研究：以尖吻鲈和大西洋鲑为例揭示黏膜免疫研究新策略

本刊推荐：为解决鱼类黏膜免疫研究中黏液采样与黏蛋白定量标准化难题，研究人员系统比较了玻璃片、拭子、Super·SALTM和组织提取四种采样方式，以及苔黑酚法、膜上聚糖法和A230吸收法三种检测技术。研究发现拭子采样结合膜上聚糖检测法最具应用潜力，为鱼类黏膜防御机制研究和病原-宿主互作研究提供了关键技术支撑。

　　

在水产养殖业迅猛发展的今天，鱼类疾病防控正面临前所未有的挑战。作为抵御病原入侵的第一道防线，鱼类体表黏液层蕴含着包括黏蛋白在内的多种生物活性分子，这些高度糖基化的蛋白质不仅构成黏液的物理屏障，更通过其聚糖结构与病原体直接互作，调控群体感应、毒力表达等关键生物学过程。然而由于缺乏标准化研究手段，科学家们长期受困于黏液采样效率低下和黏蛋白定量不准两大技术瓶颈——不同采样方式可能导致样本交叉污染，而传统检测方法难以准确反映高度糖基化的黏蛋白真实含量。

针对这一难题，由瑞典哥德堡大学Kyung Min Lee与John Benktander领衔的国际研究团队在《Marine Biotechnology》发表最新成果，系统比较了尖吻鲈（Lates calcarifer）和大西洋鲑（Salmo salar）不同上皮部位黏液采样与黏蛋白半定量方法。研究人员创新性地将现代糖组学分析与传统生化检测手段相结合，为鱼类黏膜免疫研究提供了关键方法学支撑。

研究采用四种临床常用采样方式：玻璃片刮取法、棉拭子擦拭法、Super·SALTM吸收垫法和全组织提取法，分别采集两种鱼类的皮肤、口腔、鳃和肠道黏膜样本。在检测方法层面，除常规的苔黑酚法（检测中性己糖）和A230紫外吸收法外，团队特别优化了基于生物素酰肼特异识别顺式二醇结构的膜上聚糖检测法。通过液相色谱-质谱（LC-MS）对O-聚糖进行精细解析，研究首次建立了物种特异性的糖基化校正因子数据库。

拭子采样展现卓越适用性

研究发现棉拭子在所有采样场景中表现最为均衡：既能从皮肤、口腔、鳃和肠道获取足量样本，又有效避免了Super·SALTM在大型鱼类应用中的局限性（条形码显色机制需≥1.0 mL黏液）和玻璃片刮取易导致的组织损伤问题。特别在口腔采样中，拭子法成功规避了食物残渣污染，而肠道样本采集通过手术器械辅助实现了黏膜层与内容物的精细分离。

糖基化差异颠覆定量认知

LC-MS聚糖分析揭示出惊人发现：不同物种及上皮部位的黏蛋白糖基化程度存在数量级差异。大西洋鲑皮肤黏蛋白平均每个聚糖仅含0.25个非胺己糖，而尖吻鲈肠道黏蛋白达1.2个，常用标准品猪胃黏蛋白（PGM）更是高达1.9个。这意味着使用苔黑酚法检测时，若以PGM为标准曲线，对大西洋鲑皮肤黏蛋白的浓度低估可达7.6倍！相比之下，膜上聚糖法检测的终端单糖（唾液酸、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺等）在不同样本间仅存在1.6倍差异，显著提升跨物种比较的可靠性。

膜上聚糖法实现技术突破

实验数据显示，膜上聚糖法不仅灵敏度显著优于苔黑酚法（能检测所有样本），更克服了A230吸收法受非黏蛋白成分干扰的缺陷。后者在黏液粗提物中显示浓度虚高7-200倍，但在纯化黏蛋白样本中与膜上聚糖法结果高度一致。研究同时发现样本浓度与A260/A280吸收值呈指数关系，与A230呈线性关系，提示浓度标准化对纯度评估至关重要。

波长扫描揭示样本纯度特征

所有黏液提取物在230nm处均呈现特征吸收峰，但鳃组织匀浆样本在260-280nm区域出现显著肩峰（达230nm峰高的50-70%），提示核酸等污染物含量较高。研究建议通过比较相似浓度样本的全波长扫描图谱，快速评估样本纯度。

这项研究为鱼类黏膜免疫研究提供了关键方法学范式：棉拭子采样结合膜上聚糖检测法构成最优技术组合，其中拭子采样兼顾操作便捷性与样本代表性，而膜上聚糖法通过靶向聚糖终端表位（正是病原体识别关键位点），实现生物学功能相关浓度的精准定量。研究者特别强调，标准品选择必须考虑糖基化差异，跨物种比较时建议采用物种特异性校正因子。

该技术体系的建立不仅推动鱼类黏膜免疫研究走向精准化，更为水产养殖病害防控提供新思路——通过监测黏膜黏蛋白组成动态，有望早期预警疾病发生；而基于黏蛋白-病原体互作机制开发的黏膜疫苗，或将成为替代抗生素的绿色防控新策略。随着更多鱼类聚糖数据库的建立，这套方法学框架有望扩展至其他经济鱼种，最终构建水产动物黏膜免疫大数据库，为精准水产医学时代奠定基石。