SmMAPK3介导的SmRAS1磷酸化：水杨酸诱导丹参毛状根中丹酚酸积累的关键机制

本文揭示了水杨酸（SA）通过激活SmMAPK3激酶磷酸化Rosmarinic Acid Synthase 1（SmRAS1）第178位丝氨酸（Ser178），进而增强SmRAS1蛋白稳定性并促进丹酚酸生物合成的分子机制。该研究阐明了SA-SmMAPK3-SmRAS1信号模块通过翻译后修饰调控次生代谢的新途径，为丹参（Salvia miltiorrhiza）代谢工程和产量提升提供了重要理论靶点。

　　

3 Results

3.1 SmMAPK3 Is Essential for SA-Induced Biosynthesis of Salvianolic Acid

通过构建SmMAPK3过表达（OE）和RNA干扰（RNAi）的转基因毛状根系，研究发现SmMAPK3-OE系中迷迭香酸（RA）和丹酚酸B（SalB）含量显著增加，最高分别提升3.87倍和3.02倍。相反，SmMAPK3-RNAi系中这两种化合物的含量显著降低。经50μM SA处理后，SmMAPK3-OE5毛状根中RA和SalB含量显著上调，而SmMAPK3-RNAi18系中未观察到显著变化，表明SmMAPK3对SA诱导的丹酚酸生物合成至关重要。

3.2 The Kinase Activity of SmMAPK3 Is Critically Relied Upon for the SA-Induced Biosynthesis of Salvianolic Acids

为探究SmMAPK3的激酶活性是否必需，研究构建了组成型活性突变体（CA-SmMAPK3-OE）和自磷酸化失活突变体（SmMAPK3^K70R-OE）。CA-SmMAPK3-OE系出现植株过敏反应和毛状根早衰现象，RA和SalB含量大幅降低（85%-89%）。SmMAPK3^K70R-OE系中丹酚酸含量也显著降低。SA处理对SmMAPK3^K70R和SmMAPK3-RNAi转基因材料中的丹酚酸含量无显著影响，证明SmMAPK3的激酶活性是SA调控丹酚酸生物合成的关键。

3.3 SmMAPK3 Interacts With SmRAS1

通过酵母双杂交（Y2H）筛选获得41个与SmMAPK3互作的蛋白，其中SmRAS1作为丹酚酸生物合成过程的关键酶引起关注。Y2H、体外pull-down、CoIP、LCI、BiFC和MST实验均证实SmMAPK3与SmRAS1存在直接相互作用，且互作发生在细胞质和细胞核中。MST测定显示SmRAS1与SmMAPK3的解离常数（K_d）为0.15μM。

3.4 SmMAPK3 Phosphorylates SmRAS1 at Serine 178

体外激酶实验显示CA-SmMAPK3-His具有强自磷酸化活性，并能显著提高SmRAS1-GST的磷酸化水平。在本氏烟中瞬时表达实验进一步验证CA-SmMAPK3可增强SmRAS1的磷酸化，且λPPase处理证实电泳迁移率变化源于磷酸化。分子对接预测发现SmMAPK3与SmRAS1的Ser178和Pro179位点相互作用。点突变实验证实SmRAS1^S178A（模拟非磷酸化状态）不能被磷酸化，而SmRAS1^S178D（模拟持续磷酸化状态）可被磷酸化，证明Ser178是SmMAPK3的磷酸化位点。

3.5 Phosphorylation of S178 Promotes the Accumulation of Salvianolic Acids

成功获得SmRAS1-OE、SmRAS1-Cas9 knockout、SmRAS1^S178D-OE和SmRAS1^S178A-OE毛状根系。SmRAS1-OE系中RA和SalB含量显著增加（1.35-1.52倍），而SmRAS1-Cas9系中含量急剧下降（约96%）。SmRAS1^S178D-OE促进丹酚酸积累（RA增加1.84倍，SalB增加2.88倍），而SmRAS1^S178A-OE对丹酚酸积累无显著影响，表明SmMAPK3通过磷酸化SmRAS1的Ser178位点促进丹酚酸积累。

3.6 The Stability of the Phosphorylated SmRAS1 Protein Is Enhanced

细胞游离降解实验显示SA、MG132和CA-SmMAPK3-myc均能显著增强SmRAS1和SmMAPK3蛋白的稳定性。在稳定表达SmRAS1-GFP的丹参毛状根中，SA处理增强了SmMAPK3-OE/SmRAS1-OE8中SmRAS1-GFP蛋白的稳定性。这些结果证明SmRAS1的磷酸化增强了其蛋白稳定性。

3.7 SA Promotes the Phosphorylation of SmRAS1 by SmMAPK3

LCI实验发现1.50mM SA处理显著增强SmMAPK3-nLuc与SmRAS1-cLuc的互作信号，而SmMAPK3^K70R-nLuc与SmRAS1-cLuc的信号显著减弱。Phos-tag凝胶电泳显示SA处理增强SmMAPK3的磷酸化（最高在20分钟）和SmRAS1的磷酸化水平。在丹参毛状根中同样证实SA促进SmMAPK3介导的SmRAS1磷酸化。

3.8 SA Promotes the Accumulation of Salvianolic Acids in the Double-Transgenic Hairy Roots of SmMAPK3 and SmRAS1

获得SmMAPK3-OE/SmRAS1-OE、SmMAPK3^K70R-myc/SmRAS1-OE和SmMAPK3-RNAi/SmRAS1-OE双转基因毛状根系。SmMAPK3-OE/SmRAS1-OE系中RA和SalB含量显著上调（2.96倍和2.79倍），高于单SmRAS1-OE系。SA处理促进SmMAPK3-OE/SmRAS1-OE8中RA和SalB积累，而对SmMAPK3-RNAi/SmRAS1-OE1和SmMAPK3^K70R-myc/SmRAS1-OE3无显著影响，表明SA-SmMAPK3-SmRAS1模块在调控丹酚酸合成中具有叠加效应。

4 Discussion

SA作为植物重要的防御激素，在调控次生代谢中发挥关键作用。本研究阐明SmMAPK3在SA诱导的丹酚酸生物合成中的核心地位，其功能依赖于激酶活性。通过磷酸化SmRAS1的Ser178位点，SmMAPK3增强SmRAS1蛋白稳定性，从而促进丹酚酸积累。SA处理不仅增强SmMAPK3与SmRAS1的互作，还通过激活SmMAPK3激酶活性促进SmRAS1磷酸化。这一发现揭示了SA通过翻译后修饰调控次生代谢的新机制，为丹参代谢工程提供了重要靶点。研究还发现持续激活SmMAPK3可能引发过敏反应，提示激酶活性的精细调控对维持细胞稳态至关重要。未来的研究将探索SmMAPK3介导的其他调控网络，为提高丹参次生代谢产物产量提供新策略。