基于聚乙烯亚胺修饰碳点（sCDP）递送RNA纳米农药实现多种真菌病害的高效绿色防控

本刊推荐：本研究创新性开发聚乙烯亚胺修饰碳点（sCDP）纳米载体，通过静电复合形成sCDP-dsRNA复合物，显著增强dsRNA环境稳定性（叶面持效期＞14天）并降低叶片接触角27.1°（vs. 水113.9°）。该平台能高效递送靶向RsDCL1/2基因的dsRNA，在实验室和田间条件下对水稻纹枯病防治效果达93.3%，对黑曲霉（Aspergillus niger）、灰霉（Botrytis cinerea）、稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）和豆薯层锈菌（Phakopsora pachyrhizi）均展示广谱抗真菌活性，为RNA干扰（RNAi）技术在农业病害绿色防控中的应用提供了新范式。

　　

引言

作物在整个生长和采后阶段持续易受多种病原体和害虫侵害，导致全球重大的粮食和经济损失。目前这些病害和害虫主要依靠化学杀虫剂和杀菌剂控制，但这些化学物质会在环境中留下有害残留。尽管广泛使用杀菌剂和杀虫剂，微生物病原体和害虫仍分别造成约14.5%和15.1%的作物产量损失。在全球粮食安全问题日益突出的背景下，开发环境可持续的病害管理方法受到越来越多的重视。当前对单一化学杀菌剂的依赖已证明不足以满足水稻稻瘟病等可持续病害管理的不断变化的需求，凸显了对创新控制策略的迫切需求。

1998年，Fire和Mello在线虫中阐明了一种保守的基因沉默机制，随后被称为RNA干扰（RNAi）。后续研究证实RNAi存在于多种生物中，包括烟草、拟南芥、昆虫和哺乳动物，确立了其在真核生物中的普遍性。典型通路涉及Dicer介导的双链RNA加工成成熟microRNA（miRNA）或小干扰RNA（siRNA），随后与Argonaute（AGO）家族蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体（RISC）。最近，RNAi机制的发现促使人们探索其在病原体控制方面的生物技术潜力，主要通过喷雾诱导基因沉默（SIGS）策略。有效的SIGS实施需要两个关键前提：（1）目标病原体高效摄取环境中的siRNA，（2）病原体内具有功能的RNAi机制。由于RNA在土壤环境中快速降解，最大限度地减少了残留毒性问题，该方法在真菌病害管理方面表现出特别的前景。

先前研究发现，立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的RsDCL1和RsDCL2基因是参与致病过程的关键毒力因子。此外，这些dicer-like基因在宿主感染期间的转录上调突显了它们在真菌致病性中的重要调控作用。靶向沉默这两个基因显著损害了R. solani的生存能力，确立了它们作为最佳分子靶点。因此，我们通过体外转录针对RsDCL1/2设计了dsRNA构建体用于SIGS应用。然而，实际应用面临挑战，因为RNA在田间条件下的不稳定性是SIGS-based植物病原体控制中的一个持续限制因素。因此，增强双链RNA（dsRNA）在叶面施用后的环境稳定性是推进喷雾诱导基因沉默（SIGS）在作物保护中应用的关键研究重点。

纳米材料，根据国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的定义，是特征尺寸在1到100纳米之间的工程结构，已在生物医学学科中展示了变革潜力，包括靶向药物递送、肿瘤治疗和遗传疾病治疗。这一成功促进了它们在农业应用中的适应。最近在基于RNA的农药应用中纳米材料的进展表明，在增强dsRNA稳定性、递送效率和田间功效方面取得了显著进展。

纳米载体，如阳离子聚合物、生物粘土和壳聚糖基纳米颗粒，能有效保护dsRNA免受环境降解（例如，紫外线辐射、核酸酶和雨水侵蚀），同时增强其与植物表面的粘附以及被目标害虫或病原体的摄取。例如，基于阳离子聚合物的纳米载体保护dsRNA免受昆虫肠道中碱性降解，从而提高了如甜菜夜蛾等害虫的RNAi效率。类似地，生物粘土纳米片减少了由于喷雾漂移和雨水侵蚀造成的dsRNA损失，延长了其在叶片上的持久性并增强了作物的抗病毒性。纳米材料还通过促进dsRNA穿透物理屏障（例如，昆虫角质层或微生物细胞壁）和促进细胞内运输来实现靶向递送。例如，胺功能化纳米颗粒在酸性内体中表现出pH响应性质子化，引发溶酶体逃逸和细胞质dsRNA的释放。

基于RNA的农药采用SIGS技术，通过外源应用特异性靶向并抑制关键病原体基因表达的小干扰RNA（siRNA）来实现植物病害控制。SIGS平台展示了显著的优势，包括应用简单性和序列特异性靶向，将其定位为一种有前景的作物保护策略。然而，将这项技术推广到农业应用面临着重大的技术挑战。一个主要限制在于在多变环境因素和核酸酶降解的田间条件下保持RNA稳定性。纳米颗粒大致分为三类：有机、无机和碳基系统，代表性例子包括脂质体复合物、层状双氢氧化物和碳纳米管。这些纳米载体在哺乳动物基因治疗中展示了靶向递送siRNA/dsRNA治疗剂的巨大潜力，表明通过RNA干扰在植物病原体管理中具有平行应用。虽然传统合成纳米材料的高成本限制了其在田间的应用，但设计和合成具有高递送效率和低成本的多功能纳米载体是发展方向。

碳点（CDs）是碳基纳米材料的一个子类，直径小于10纳米，具有独特的优势，包括卓越的生物相容性、成本效益高的合成和环境可持续性。碳点通常通过两种方法合成：“自上而下”或“自下而上”。自下而上合成碳点的实验方法通常更简单。先前对碳点的研究主要集中在其光学性质上，并且它们已经应用于各个领域，包括生物成像、光催化、光伏电池和发光二极管。因此，碳点（CDs）展示了农业创新的巨大潜力，将其定位为可持续作物管理和精准农业纳米材料应用的新兴前沿。植物生物技术中的新兴研究展示了应用碳点（CDs）作为工程化纳米载体用于RNA递送。例如，使用不同尺寸的碳点纳米颗粒促进siRNA进入转基因烟草植物和番茄，能够系统评估纳米尺度尺寸与RNAi功效和目标蛋白抑制的相关性。

在本研究中，我们开发了一个多组分纳米生物农药平台，利用新型聚乙烯亚胺修饰碳点（sCDP）递送dsRNA。在该平台中，选择两种低成本且易得的生物质材料——菌渣和蕨类作为碳源来制备碳点。此外，使用聚乙烯亚胺（PEI）功能化其表面胺基，产生能够有效结合和稳定dsRNA的功能化碳点。该方法旨在提高基于RNA的纳米农药的环境稳定性和生物功效，同时开发用于水稻纹枯病可持续管理的RNAi纳米平台。

结果与讨论

PEI修饰碳点的制备与表征

碳量子点（CQDs）因其纳米级尺寸（<10纳米）和可调表面化学而成为特别有前景的候选者。在此，我们开发了一种新型的基于CQD的递送平台，专门设计用于克服RNA农药应用中的三个关键挑战：分子稳定性、细胞摄取效率和持续生物活性。本研究通过一步水热法（180°C，20小时，自生压力下）合成了一种新型PEI功能化碳量子点（CQD），通过阳离子表面工程实现dsRNA稳定。由于CQD合成的原材料来自农业废弃物蘑菇渣，该材料易于获取且非常廉价，这确保了与一些已建立的纳米载体（例如，生物粘土、壳聚糖NPs）相比，纳米材料的低成本及其后期市场应用的可能性。此外，通过切向流过滤（10 KDa MWCO）和冻干进行合成后纯化，产生了三种 resultant 纳米材料，分别命名为sCDP（蘑菇来源）、pCDP（蕨类来源）和mCDP（1:1复合物）。利用透射电子显微镜研究碳量子点的形态特征。图像显示sCDP由尺寸均匀的准球形结构组成。在超纯水（ddH₂O）中的动态光散射（DLS）分析显示流体动力学直径分别为3.06纳米（sCDP）、4.15纳米（pCDP）和9.20纳米（mCDP）。同时，ζ电位测量证实了强烈的正表面电荷（sCDP为+5.34毫伏，pCDP为+2.97毫伏，mCDP为+8.38毫伏），这对于与dsRNA的静电复合至关重要。这些结果表明dsRNA有可能静电吸附到CQDs的表面。此外，还发现UV-Vis光谱识别出双重吸收特征：277纳米的尖锐π-π跃迁峰（C=C芳香体系）和集中在500纳米的宽可见区吸收，归因于表面氧/氮部分中的n-π跃迁。此外，采用X射线光电子能谱（XPS）分析固体表面的元素组成和价态。结果显示所有三个样品都是氮掺杂的纳米材料，其表面存在亲水基团。氮以氨基或酰胺基的形式存在于纳米材料表面，其正电荷有助于与带负电的dsRNA结合。上述发现表明，sCDP作为一种新型碳基纳米材料，在高效dsRNA粘附和封装方面展现出巨大潜力。利用蘑菇渣的可持续纳米材料合成策略通过废物价值转化实现了环境和经济双重效益。与传统前体相比，该方法降低了生产成本，同时解决了废物管理挑战。

CDPs形成复合物的dsRNA负载能力

RNA纳米复合物中过高的sRNA负载会通过胶体不稳定性机制诱导纳米颗粒聚集，导致由于细胞内在化过程受损而损害基因沉默效率。因此，在本研究中，首先确定了dsRNA负载能力和最佳质量比。先前发现dsRNA可以在不同质量比下与CQD复合。为了评估三种碳量子点纳米颗粒负载dsRNA的能力，将三种不同的碳点变体（sCDP、pCDP和mCDP）与RsDCL1/2-dsRNA在递增的质量比下进行滴定，随后在室温下孵育15分钟以促进静电复合物形成。当电泳泳道中出现条带溢出时，表明碳点与dsRNA的最大负载比已超过。结果显示，sCDP与dsRNA的最大负载质量比为5:1，pCDP与dsRNA为6:1，mCDP与dsRNA为5:1。当达到最大负载质量比时，没有dsRNA条带在泳道中迁移，证实了dsRNA的完全负载。这表明CQD在与RsDCL1/2-dsRNA结合方面具有优异性能。为了进一步证明sCDP和dsRNA的成功结合，分析了sCDP、pCDP和mCDP碳点在负载dsRNA前后的紫外-可见吸收光谱。结果显示，与单独的sCDP相比，负载dsRNA后碳点的紫外-可见吸收光谱发生红移现象。红移现象是指当有机化合物结构发生变化时，最大吸收峰波长向长波方向移动的现象。这通常是由分子中引入官能团或发色团引起的。观察到的红移模式与图1g中所示的dsRNA负载效率直接相关，证明了通过碳点的芳香域和dsRNA的核碱基之间的电子共轭成功形成了复合物。此外，如图所示，完整光谱谱图的合并证实了稳定的sCDP-dsRNA超分子组装，离散纳米颗粒吸收带的消失表明在最佳质量比下表面达到饱和。

sCDP对dsRNA的显著稳定性效应

裸露dsRNA固有的易受核糖核酸酶介导的水解、紫外线诱导的链断裂和热变性的特性，构成了阻碍SIGS农业转化的基本限制，需要先进的纳米封装策略来实现RNA稳定化和递送优化。此外，纳米封装递送系统保护dsRNA免受核酸酶降解的能力是影响RNAi效率的关键因素。为了评估碳点纳米材料是否能有效保护dsRNA免于降解，将制备的CQD-dsRNA复合物暴露于20纳克的RNase A。如图所示，核糖核酸酶保护试验表明碳点变体之间存在显著的差异化稳定能力，其中sCDP-dsRNA复合物在暴露80分钟后表现出比未受保护的dsRNA高48.8%的核酸酶抗性，优于其pCDP和mCDP对应物。与sCDP-dsRNA相比，pCDP-dsRNA复合物抵抗RNase A降解的能力下降了9.8%。同时，mCDP-dsRNA复合物与对照组相比没有显著差异。这些结果可能源于sCDP优化的阳离子界面，它提供了卓越的静电屏蔽以抵抗RNase活性，结合了dsRNA的π-π堆叠稳定化，这与已建立的碳纳米载体介导的核酸保护机制一致。除了RNA降解酶，自然界中紫外线诱导的dsRNA断裂也是限制RNAi有效性的重要因素。为了研究三种纳米材料对dsRNA抗紫外线辐射能力的影响，制备了CQD-dsRNA样品并暴露于紫外线0、3、6、9和12小时。然后分析这些样品的条带密度。如图所示，裸露的dsRNA在紫外线照射12小时后几乎完全降解，而与纳米材料复合的dsRNA保留了结构完整性。此外，sCDP-dsRNA、pCDP-dsRNA和mCDP-dsRNA复合物抵抗紫外线降解的光保护功效分别提高了58.8%、49.8%和45.8%。

除了RNase A和紫外线辐射，还评估了三种纳米材料-dsRNA复合物的热稳定性。为了研究抵抗高温降解的保护效果，将裸露的dsRNA和sCDP-dsRNA复合物在37°C下分别孵育0、3和7天，然后分析不同处理组的条带密度。如图所示，裸露的dsRNA在37°C孵育7天后仅保留50%的完整性，而负载纳米材料的dsRNA保持了一定水平的条带完整性。具体而言，sCDP-dsRNA复合物在37°C孵育7天后几乎未显示降解，而与裸露dsRNA相比，pCDP-dsRNA和mCDP-dsRNA复合物的热稳定性能力分别提高了34.8%和10.1%。

传统农化物的功效因降水介导的冲刷而显著降低，通常在25毫米降雨后保留<20%的初始沉积。纳米农药通过先进的物理化学机制表现出比传统配方显著增强的耐雨性。先前研究表明，农药喷洒后与水稻表面的粘附显著影响其功效。接触角是反映农药与叶片之间亲和力的重要指标。为了评估洗涤对CQD-dsRNA在植物叶片上的稳定性和附着力的影响，测量了sCDP-dsRNA、pCDP-dsRNA和mCDP-dsRNA的接触角。如图所示，与H₂O和裸露dsRNA相比，使用碳点负载的dsRNA时，接触角有不同程度的降低。具体而言，sCDP-dsRNA实现了76.2%的降低（27.1°对比H₂O的113.9°），而pCDP-dsRNA显示出中等改善（降低13.6%），mCDP-dsRNA在统计上与对照组无差异。这种层次结构可能与zeta电位测量相关，因为碳量子点材料的阳离子表面电荷密度通过静电相互作用与带负电的叶片角质层调节液体表面张力。这些发现表明sCDP-dsRNA复合物更容易在植物叶片上分布和铺展。带正电的纳米材料能有效降低sCDP-dsRNA复合物液滴的表面张力，有助于其扩散和粘附到叶片表面。此外，为了评估洗涤对sCDP-dsRNA在植物叶片上的稳定性和附着力的影响，通过室内模拟雨水冲刷试验进一步研究了sCDP-dsRNA的抗雨水侵蚀能力。使用酸滴定管作为雨水发生器，利用激光共聚焦显微镜观察雨水冲刷前后水稻叶片荧光变化。如图所示，用去离子水洗涤10次后，仅用eGFP-dsRNA处理的稻叶表面只有非常微弱的绿色荧光，而sCDP-eGFP-dsRNA处理组仍保持强烈的荧光强度，主要集中在叶脉和气孔处。这表明sCDP纳米材料可能通过降低dsRNA在水稻叶片表面的接触角来改善其粘附性和耐冲刷性，这有利于提高RNA农药的利用效率。

sCDP增强dsRNA进入R. solani和植物细胞的摄取效率

纳米递送系统已被应用于增强农药在植物中的转运。本研究定量评估了碳量子点介导的dsRNA在R. solani中的递送功效，解决了基于RNAi的真菌控制策略中的关键挑战。为了研究这些纳米颗粒是否增强真菌吸收，合成了荧光YFP-dsRNA及其纳米复合物，应用于真菌菌丝，然后对经核酸酶处理的样本进行共聚焦激光扫描显微镜分析以区分内化的RNA。结果显示，没有结合纳米材料时，裸露YFP-dsRNA的荧光强度很弱。然而，经sCDP-dsRNA和pCDP-dsRNA复合物处理的组的荧光强度分别是对照组的3.3倍和2.2倍，并且mCDP-dsRNA复合物处理组也显示出一定程度的增强。为了描绘sCDP-dsRNA复合物的亚细胞运输，对立枯丝核菌AG1-IA菌丝的透射电子显微镜（TEM）超微结构分析揭示了纳米颗粒在细胞质囊泡（直径50-80纳米，用红色箭头表示）和周质空间中的积累，表明sCDP-dsRNA复合物可以转运穿过R. solani细胞的质膜。上述结果可能是由于真菌吸收效率与纳米颗粒zeta电位梯度之间的相关性，这促进了真菌细胞壁和几丁质之间的互补电荷相互作用，或者是由于较小的颗粒尺寸。植物对纳米农药的摄取和生物积累在其生物活性和RNAi的高效功能中起着至关重要的作用。随后测定了碳量子点介导的dsRNA被植物叶片摄取的效率。如图所示，YFP-dsRNA在O. sativa叶片中内化的荧光定量揭示了纳米颗粒增强的叶面摄取，sCDP-dsRNA复合物在12小时孵育（28°C，16/8小时光/暗）和RNase A预处理以消除表面结合核酸后，显示出比裸露dsRNA对照组高2.8倍的荧光强度。而pCDP-dsRNA和mCDP-dsRNA处理显示出中等但显著的增强（分别为1.6倍和1.7倍）。那可能是由于sCDP-dsRNA复合物的小颗粒尺寸和减小的接触角。为了更直观地观察sCDP-dsRNA复合物的摄取，通过TEM对水稻叶片中的sCDP-dsRNA进行了超微结构检查。结果显示，纳米颗粒在细胞质囊泡和气孔保卫细胞内的积累（用红色箭头表示），表明sCDP-dsRNA复合物可以转运穿过植物叶片的质膜和气孔。此外，在用sCDP-YFP-dsRNA处理的水稻叶肉细胞中也观察到显著的荧光信号，而仅用裸露YFP-dsRNA处理的组只观察到微弱的荧光信号。综上所述，这些结果表明sCDP可以有效地将dsRNA递送到水稻叶细胞中，促进siRNA进一步运输到R. solani中以发挥相应作用。

sCDP表现出高生物相容性并增强dsRNA对抗R. solani的功效

纳米 enabled dsRNA对疾病控制表现出显著的保护作用。例如，Mitter及其同事阐明，粘土纳米片可用于RNAi的局部递送，提供对植物病毒的持续保护。此外，Wang及其同事证明，应用SPc负载的dsPiHmp1或dsPiCut3在24小时后强烈保护叶片免受致病疫霉感染，而裸露dsRNA由于dsRNA的有限摄取和不稳定性而没有保护作用。Qiao及其同事发现，与裸露dsRNA相比，AV-dsRNA随时间推移保持生物活性，并对灰霉病菌提供更长的保护期。水稻纹枯病由土传真菌R. solani引起，在全球范围内造成严重的产量损失。先前，宿主诱导基因沉默（HIGS）和SIGS策略已成功抑制R. solani；然而，这些技术在疾病预防和控制方面的有效性表现出不稳定性，保护持续时间未能达到最佳阈值。在本研究中，我们合成了一种新型纳米材料，可有效保护dsRNA免于酶降解，增强其环境稳定性，并促进植物-病原体相互作用的运输和吸收。为了评估纳米材料在125-1000 mg/L浓度范围内是否影响R. solani菌丝生长，我们分别在PDA培养基上用sCDP、pCDP和mCDP处理真菌块12小时和24小时。统计分析显示，在12小时和24小时时，纳米材料处理组与ddH₂O对照组之间的菌落直径没有显著差异，即使在最大浓度下也是如此。1000 mg/L处理的菌丝的激光共聚焦显微镜显示与对照组相比没有形态异常。上述结果表明纳米材料本身对R. solani的生长没有抑制作用。此外，纳米材料是否会对非目标生物体产生毒性也是其应用时需要考虑的重要因素。鉴于非目标生物安全性的重要性，我们评估了sCDP、pCDP和mCDP在200 mg/L（应用的dsRNA浓度）下对水稻生长的影响，并评估了不同浓度梯度对水稻幼苗生长和种子萌发的影响。结果显示，每周叶面喷洒和根部施用（H₂O对照）在四次处理后没有表现出表型差异。根长、茎高、鲜重和干重的定量分析显示处理组和对照组之间没有显著差异。此外，萌发分析表明，浓度范围从10到1000 mg/L的sCDP、pCDP和mCDP对水稻种子活力没有抑制作用。随后的统计评估显示，在所有测试浓度下，萌发后参数（根和茎长度）没有显著差异。上述结果进一步证明了sCDP、pCDP和mCDP优异的生物相容性。

为了验证纳米颗粒是否有助于更好地发挥RNA杀菌剂的功效，我们评估了sCDP-RsDCL1/2-dsRNA复合物抑制病原体生长的能力。用R. solani接种的水稻（叶片处理24小时）在感染部位局部施用不同溶液。发现sCDP-RsDCL1/2-dsRNA复合物处理组显示病斑面积显著减少。具体而言，与用H₂O或YFP-dsRNA溶液处理的对照组相比，sCDP-RsDCL1/2-dsRNA复合物使病斑面积减少了约93.3%。此外，与裸露RsDCL1/2-dsRNA处理组相比，sCDP-RsDCL1/2-dsRNA复合物导致病斑面积减少约67.8%，并且显示出比其他两种纳米材料复合物（pCDP和mCDP）更高的功效。这一发现与先前表征中的纳米颗粒增强的RNA稳定性和真菌摄取效率指标一致。基于这些发现，我们得出结论，应用sCDP-RsDCL1/2-dsRNA复合物显著抑制了R. solani的致病过程，表明纳米材料可以增强dsRNA的RNA干扰效率。

sCDP通过双重机制增强dsRNA对抗R. solani的活性

主流假设表明，喷雾诱导基因沉默（SIGS）通过双重机制发挥作用：（1）病原体直接摄取RNA分子，以及（2）宿主吸收后通过植物介导的转移给病原体。然而，这些通路之间的协同相互作用及其在增强基因沉默功效方面的分子 interplay 仍然缺乏表征。最近的研究表明，溶菌酶包被的LDH纳米颗粒可以有效地将功能性核酸递送到植物中。为了评估sCDP介导的系统性dsRNA运输能力，我们进行了远端攻击试验，以测量sCDP-RsDCL1/2-dsRNA纳米复合物对R. solani致病性的功效。三种不同的配方（H₂O对照、裸露eGFP-dsRNA和sCDP-eGFP-dsRNA纳米复合物）在病原体接种前24小时施用于水稻叶片，接种点距离处理应用点8厘米，在处理应用区和感染区之间建立空间分离。发现与H₂O处理组相比，裸露RsDCL1/2-dsRNA处理组和sCDP-RsDCL1/2-dsRNA复合物处理组的病斑面积分别减少了41%和64%，而病原真菌生物量分别减少了约69%和83%。此外，在sCDP-RsDCL1/2-dsRNA复合物处理组中，RsDCL1和RsDCL2基因的表达水平分别降低了50%和58%，这比裸露RsDCL1/2-dsRNA处理组降低了约20%。上述结果也证实了先前的表型结果，例如sCDP-RsDCL1/2-dsRNA复合物处理中的菌丝生长缺陷。此外，为了可视化分析叶面施用的dsRNA被植物吸收并运输到病原真菌的过程，我们在体外合成了荧光标记的eGFP-dsRNA及其与纳米材料的复合物。类似地，将H₂O、裸露eGFP-dsRNA和sCDP-eGFP-dsRNA复合物与水稻叶片共孵育24小时，随后在距离孵育点8厘米处接种R. solani。用R. solani接种水稻植株后，分别在15、30、60和120分钟的时间间隔处理样品。然后我们使用Zeiss激光共聚焦显微镜检测菌丝的荧光信号。结果显示，在sCDP-eGFP-dsRNA复合物处理组中，15分钟时已经可以检测到微弱的荧光。随着孵育时间的延长，荧光强度变得更强。与裸露eGFP-dsRNA处理组相比，sCDP-eGFP-dsRNA复合物处理组中菌丝的荧光强度在相同时间点高出约两倍。这些发现表明，叶面施用的dsRNA是可移动的，并且sCDP增强了植物对外源dsRNA的吸收和运输，使其能够转移到R. solani中，从而在病原体中触发RNAi，抑制其致病性。随后，我们对R. solani进行了双重处理。如前所述，我们将水稻叶片与三种不同的溶液：H₂O、裸露RsDCL1/2-dsRNA和sCDP-RsDCL1/2-dsRNA复合物共孵育24小时，随后在距离孵育点8厘米处接种R. solani。同时，在接种点施用相同的三种溶液。结果表明，用sCDP-RsDCL1/2-dsRNA进行双重处理，与H₂O双重处理组相比，病斑面积显著减少了99.92%，与直接接触sCDP-RsDCL1/2-dsRNA处理组相比减少了约8%。这些结果表明，sCDP增强了植物对外源dsRNA的吸收和运输，促进其转移到R. solani中，从而在病原体内触发RNA干扰（RNAi），有效抑制其致病性。

考虑到稳定性、吸收效率和疾病预防效果，进一步评估了sCDP纳米颗粒的保护持续时间，并进一步测试了RsDCL1/2-dsRNA对水稻的保护期延长效果。结果显示，用RsDCL1/2-dsRNA和sCDP-RsDCL1/2-dsRNA复合物处理1天，水稻叶片上的病斑面积分别减少了53.6%和89.3%。此外，用RsDCL1/2-dsRNA和sCDP-RsDCL1/2-dsRNA复合物处理7天，相对病斑面积分别减少了60.7%和72.8%。纵向保护分析显示，sCDP-dsRNA复合物具有持续的生物活性，在施用后14天仍保持46.1%的疾病抑制率，而裸露dsRNA处理则完全失效（p < 0.01），这与叶面粘附试验中观察到的囊泡储库形成相关。这些数据表明，在水稻叶片上施用sCDP-RsDCL1/2-dsRNA复合物可以提供比裸露dsRNA施用更长的保护，将疾病预防效果延长至14天。

目前，水稻纹枯病是影响世界水稻作物最重要的病害，最常用的防治方法是施用农