可扩展纯化氧化铁纳米颗粒用于器官玻璃化冷冻与移植：突破纳米复温技术临床转化的关键瓶颈

本文综述了利用切向流过滤（TFF）技术规模化纯化二氧化硅包被氧化铁纳米颗粒（sIONP）的创新方法，以解决器官玻璃化冷冻（Vitrification）和纳米复温（Nanowarming）临床转化中的核心挑战。研究表明，与传统超速离心（UC）相比，TFF能高效纯化sIONP（2.5小时处理0.72克），显著减少残留、提高稳定性（在CPA中稳定>7个月），并成功验证了经TFF-sIONP纳米复温的大鼠肾脏移植后功能恢复良好，为临床级器官库的建立提供了关键技术支撑。

　　

引言

器官移植是终末期器官衰竭的唯一治疗手段，但供体器官的短期保存限制导致大量器官未被利用。器官玻璃化冷冻通过将器官冷却至低温并转化为玻璃态，可实现器官的长期保存。然而，复温过程中避免冰晶形成和热应力裂纹仍是一大挑战。纳米复温技术通过将氧化铁纳米颗粒（IONP）与低温保护剂（CPA）共同灌注到器官血管系统中，在交变磁场下产生热量，实现快速均匀复温。该方法可扩展至大体积器官，因为射频频率穿透时衰减极小。尽管纳米复温已在大鼠器官上得到验证，但临床级器官需要大量在CPA中稳定且能有效加热的IONP。因此，开发可扩展的IONP纯化方法至关重要。

IONP纯化概述

历史上，纳米复温使用的IONP通过多种纯化方法制备，如表1所示。这些IONP已应用于多种细胞、组织和器官系统。除TFF外，其他纯化方法均未能同时实现稳定性和可扩展性，而这对于临床级器官的工作是必需的。首次纳米复温演示使用了EMG 308，这是一种商业化的表面活性剂包被的IONP核心，价格低廉但无法在CPA中长期稳定。为提高稳定性，研究人员开发了介孔二氧化硅IONP（msIONP），实现了在CPA中的稳健胶体稳定性，但合成和处理过程需要数天，且涉及高温和CTAB去除，过程繁琐。其他研究通过透析和磁分离纯化IONP，但这些方法劳动强度大、耗时且难以扩展。超速离心（UC）纯化方法需要数天完成，限制了其临床纳米复温实践的可扩展性。

传统UC方法存在显著的可扩展性限制，包括劳动密集型过程、IONP再分散困难、需要大量乙醇（2升），以及处理0.72克IONP需要3天时间，导致150-250毫克IONP损失，并在洗脱后肾脏中出现棕色残留物。相比之下，切向流过滤（TFF）是一种动态过滤过程，仅需2小时30分钟即可纯化相同量的铁（0.72克）。TFF允许IONP在压力下切向流过选择性渗透膜，无需再分散，且不受限于尺寸有限的管子。此外，TFF无IONP损失，易于纯化后分散，并减少了肾脏洗脱后组织学中观察到的棕色残留。

纯化sIONP的表征

动态光散射（DLS）和ζ电位测量表明，TFF过程未显著影响sIONP的包被。TFF纯化的sIONP尺寸为88±5纳米，而超速离心的sIONP尺寸为93±4纳米，差异无统计学意义（p=0.210）。由于EMG 308的专有包被，ζ电位呈负值（-50±1毫伏），在非离子PEG包被存在下，超速离心sIONP降至-37±1毫伏，TFF纯化sIONP为-41±2毫伏，无显著差异（p=0.204）。透射电子显微镜（TEM）图像显示，TFF纯化的sIONP尺寸为47±3纳米，超速离心sIONP为49±1纳米，无显著差异（p=0.244）。

胶体稳定性

IONP在CPA中的稳定性对冷冻保存和纳米复温应用至关重要。不稳定的IONP可能导致器官血管系统中聚集、卸载效率低下以及加热性能下降。研究表明，EMG 308在VMP中第三天尺寸增加至118±10纳米，随后沉淀并在第四天颜色从深棕色变为浅棕色。而超速离心（90±3纳米）和TFF纯化sIONP（89±3纳米）在几天后仍保持稳定，无显著尺寸增加（p=0.708）或颜色变化。在VS55中，EMG 308在45分钟内尺寸从70±0.21纳米增加至432±6纳米，随后因沉淀颜色变浅。而超速离心sIONP（80±3纳米）和TFF纯化sIONP（81±3纳米）在第四天前无颜色变化、沉淀或统计差异（p=0.508）。两者在VMP和VS55中均保持稳定长达7个月。

加热特性和拉曼光谱

IONP被选择用于纳米复温以加热CPA系统和器官体积。因此，评估纯化方法是否影响加热性能至关重要。在360赫兹、20千安每米条件下，水中浓度为4毫克铁每毫升时，测量每种配方的每克铁特异性吸收率（SAR_Fe）。结果显示，EMG 308具有最高的SAR，而超速离心和TFF纯化sIONP的SAR略有下降，此前归因于核心-包被相互作用。超速离心和TFF纯化sIONP之间的SAR值无显著差异（p=0.452）。但EMG 308与超速离心sIONP（p=0.019）及TFF纯化sIONP（p=0.0016）之间存在显著差异。拉曼光谱用于确定IONP核心化学是否存在变化。EMG 308、未纯化sIONP、超速离心sIONP和TFF纯化sIONP在水中均显示出约490和630厘米^-1处的特征振动模式，表明磁铁矿核心结构在纯化过程中保持完整。然而，未纯化、超速离心和TFF纯化sIONP在约230和290厘米^-1处显示出弱峰，强烈表明存在拉曼活性赤铁矿（α-Fe₂O₃）的振动模式。尽管赤铁矿稳定，但具有弱磁性和反铁磁性行为，导致IONP的饱和剩磁降低。TFF和超速离心纯化样品中SAR值的降低，以及拉曼光谱表明α-Fe₂O₃的出现，表明IONP核心可能在合成和纯化过程中发生氧化。这一发现与先前报告一致，即磁铁矿（Fe₃O₄）比其氧化形式（如磁赤铁矿，γ-Fe₂O₃）具有更高的饱和磁化强度。核心氧化可能导致sIONP饱和剩磁（和SAR）的降低。

高分辨率魔角旋转核磁共振分析

二氧化硅包被的一个好处是能够附着PEG，从而增加在生物流体和CPA中的稳定性。为评估纯化后sIONP表面PEG层的存在，进行了高分辨率魔角旋转（HRMAS）核磁共振分析。样品使用已报告方法制备，并评估了3.66-3.76 ppm处的峰值（对应于PEG链末端的亚甲基质子）。超速离心和TFF纯化sIONP均显示出PEG峰信号，表明纯化后PEG层完整。值得注意的是，TFF纯化sIONP在CPA中的稳定性与超速离心sIONP在统计学上相似。

sIONP对人真皮成纤维细胞的毒性

使用人真皮成纤维细胞（HDF）在10毫克铁每毫升浓度下评估了TFF纯化sIONP的细胞毒性，并与先前使用超速离心sIONP的HDF数据进行比较。结果显示，TFF纯化sIONP具有96.7%±1%的高细胞存活率，与超速离心sIONP（95.0%±1%存活率，p=0.754）或HDF对照（98.97%±0.06%存活率，p=0.544）无显著差异。然而，EMG 308显示出最低存活率（89.67%±3.79%），与HDF对照（p=0.0023）和TFF纯化sIONP（p=0.013）存在显著差异。EMG 308与超速离心sIONP（p=0.050）以及超速离心sIONP与HDF对照（p=0.159）之间显示统计相似性。这表明纯化后完整的非离子生物相容性PEG包被的sIONP在10毫克铁每毫升浓度下暴露24小时后无毒性。

肾脏灌注CPA加载和玻璃化冷冻

使用先前的VMP协议将CPA与超速离心和TFF纯化sIONP灌注加载到肾脏中。动脉压力和流速在灌注过程中如图S5（支持信息）所示。sIONP在CPA灌注后立即以10毫克铁每毫升浓度加载，每个肾脏被插入填充有15毫升全强度VMP溶液（8.4摩尔）的聚乙烯袋中，其中含有4毫克铁每毫升。TFF纯化sIONP的加载压力在30-40毫米汞柱之间，而超速离心sIONP在恒定流速0.5毫升每分钟下在40-50毫米汞柱之间。图S6（支持信息）显示了放置在肾脏附近的光纤温度探头记录的热历史。器官冷却和玻璃化冷冻遵循先前协议，器官快速移至-150°C存储冰箱。TFF纯化sIONP的冷却速率（21.12±6.02°C每分钟）与超速离心（20.5±8.1°C每分钟）无显著差异（p=0.896），且快于肾组织中VMP的临界冷却速率（CCR）（2°C每分钟）。微型计算机断层扫描（micro-CT）和聚乙烯袋中玻璃化冷冻肾脏样本的视觉检查用于评估玻璃化冷冻。图5a显示了围绕CPA玻璃化冷冻肾脏的透明玻璃状VMP溶液。加载超速离心和TFF纯化sIONP的肾脏中sIONP溶液的深棕色阻止了肾脏的完全可视化（图5b,c）。然而，周围溶液的透明玻璃状外观和肾脏缺乏淡粉色表明TFF纯化sIONP成功玻璃化冷冻。此外，基于放射密度（以亨斯菲尔德单位（HU）表示）使用micro-CT区分冷冻和玻璃化冷冻组织。低衰减（<<400 HU）表示冷冻肾脏，而>500 HU表示玻璃化冷冻肾脏。加载CPA的肾脏（无IONP）放射密度为500±41 HU，与先前发布的玻璃化冷冻肾脏相似。加载IONP后，超速离心和TFF纯化sIONP加载肾脏的HU值增加（图5f），与早期发现一致（图S7，支持信息）。在所有肾脏区域均未检测到表示裂纹或冰结晶的低衰减区域，证实了成功玻璃化冷冻。肾脏外部观察到的低衰减/蓝色仅限于门周脂肪组织，可能由于这些血管化较差区域CPA浓度较低，意义最小。值得注意的是，HU值表明TFF纯化sIONP在VMP CPA和肾脏中实现的玻璃化冷冻与超速离心sIONP相似。

纳米复温和CPA/IONP从肾脏卸载

使用15千瓦射频（RF）线圈在94%功率下运行，场强63千安每米，频率180千赫兹，用于玻璃化冷冻肾脏的纳米复温。TFF sIONP加载肾脏（n=4）附近的复温速率为76.55±1°C每分钟，与先前发布的超速离心sIONP加载肾脏（n=6，72.0±8.0°C每分钟）相比无显著差异（p=0.161）。该速率也高于肾组织中VMP的临界复温速率（CWR）（约50°C每分钟），能够防止去玻璃化冷冻和裂纹（图S8a，支持信息）。纳米复温后，立即按照先前灌注协议灌注卸载CPA和IONP。超速离心和TFF纯化sIONP肾脏卸载期间的动脉压力和流速如图S8b,c（支持信息）所示。移植后评估通过组织学和移植研究进行。

组织学

新鲜对照肾脏、超速离心和TFF纯化sIONP加载、玻璃化冷冻、纳米复温和卸载后的肾脏被对半切开并评估组织学变化。对半切开肾脏的视觉检查显示近乎正常的大体结构，无论超速离心还是TFF纯化sIONP玻璃化冷冻和纳米复温案例中均无宏观残留或冰损伤，两者与保存在UW溶液中的新鲜对照肾脏相比均表现良好。染色肾脏4微米切片H&E显微镜显示髓质和骨盆区域有少量棕色残留，特别是在超速离心sIONP肾脏中，与先前工作一致（图6比较）。这些棕色残留物要么 localized在毛细血管中，要么外渗到间质空间中。最大残留物发现在髓质和皮质髓质交界处（图6,8；图S10，支持信息）。然而，在超速离心或TFF纯化sIONP灌注的肾脏皮质或骨盆中，无残留物大于50微米（图6,8；图S10，支持信息）。在肾小球、鲍曼氏空间以及近曲和远曲小管中发现了10至50微米的残留物。皮质髓质交界处和内髓质残留物最多（图6,8；图S10，支持信息）。然而，超速离心组在多个肾脏区域表现出显著更高的残留物含量：皮质（10-50微米，p=0.04）、皮质髓质交界处（≤10微米，p=0.0003；>50微米，p=0.024）和骨盆（10-50微米，p=0.024）（图8）。新鲜对照肾脏未显示任何棕色残留物。肾小球在两个组中均未显示病理发现，并保持完整的基底膜、鲍曼氏空间和内皮衬里，与新鲜对照相比。近曲和远曲小管表现出近乎正常的组织学发现，无小管坏死证据。髓质和小管中的收集管未显示因冰损伤导致的组织学变化（图6）。基于切向流过滤（TFF）的既定原理，我们将TFF观察到的残留物减少归因于其尺寸选择性透析过滤机制。与超速离心方法不同，TFF中的错流动力学最小化污染和聚集，实现一致且可扩展的纯化。在我们的研究中，使用100千道尔顿分子量截留膜在优化流速和压力条件下，有效去除了游离聚合物、二氧化硅副产物和未反应组分，同时保留了IONP。这一机制可能解释了TFF与超速离心相比残留物减少的原因。

sIONP卸载后肾脏中的铁定量

灌注后sIONP的有效卸载对临床应用和纳米复温的可转化性至关重要。图S9（支持信息）显示了卸载CPA和IONP后肾脏中的残留铁浓度。超速离心和TFF肾脏之间无显著差异（p=0.819），对照和超速离心肾脏（p=0.192）或对照和TFF肾脏（p=0.354）之间也无显著差异。总铁量为0.26±0.07微克铁每毫克干组织（对照），1.62±1.27微克铁每毫克干组织（超速离心肾脏），和1.23±0.78微克铁每毫克干组织（TFF肾脏）。该量与先前工作相似，未导致不良反应（2.0微克铁每毫克干组织）。值得注意的是，许多铁基药物和成像剂通常静脉给药高达2.6毫克每千克。

移植

比较玻璃化冷冻和纳米复温肾脏移植在大鼠中的结果，以评估TFF与超速离心IONP对结果的影响。将四个使用TFF颗粒的同基因肾脏移植与六个超速离心和六个新鲜对照肾脏移植从我们先前研究进行比较。所有组肾脏在松开夹子恢复血流后立即均匀再灌注（图8）。新鲜对照肾脏在再灌注时立即产生尿液，而所有纳米复温肾脏在30分钟内产生尿液。任何移植中均未检测到血管血栓形成。TFF玻璃化冷冻-纳米复温肾脏移植的血清肌酐水平监测直至正常化至少连续三天（第26天）。所有纳米复温肾脏接受者的血清肌酐水平在术后2至5天（POD）达到峰值。TFF和超速离心玻璃化冷冻纳米复温组的峰值血清肌酐分别为11.23±0.22和12.17±0.52毫克每分升，无显著差异（p=0.122）。新鲜对照移植组的肌酐水平显著低于玻璃化冷冻纳米复温组（p<0.0001）。玻璃化冷冻-纳米复温组的肌酐水平在峰值后逐渐下降，在2-3周内达到正常水平（图7），在POD 26时无统计差异。这些结果与先前研究一致。注意，我们排除了三个肾脏：一个由于手术中麻醉相关技术故障，另一个由于灌注问题，第三个由于接受者年龄问题。TFF玻璃化冷冻纳米复温肾脏在POD 26取出，显示正常大体解剖和外观，与新鲜对照移植和超速离心玻璃化冷冻纳米复温肾脏相似（图8）。无论sIONP纯化方法类型如何，移植的玻璃化冷冻-纳米复温肾脏的组织学评估显示最小局灶性小管坏死，具有完整基底膜和血管系统。任何组中均无微血栓或远端梗死。玻璃化冷冻-纳米复温和新鲜对照肾脏均表现出大血管和收集管的正常形态（图8）。使用H&E染色评估纳米复温肾脏髓质和骨盆中的残留物积累。在超速离心肾脏的皮质髓质交界处，玻璃化冷冻纳米复温后（p-VN）（p<0.0001）和移植后（p-TX）（p=0.0006），以及移植后髓质区域（p=0.012），观察到显著更高的残留物水平，与TFF肾脏相比（图9b）。在皮质（p-VN：p=0.11；p-TX：p=0.506）或骨盆（p-VN：p=0.123；p-TX：p=0.547）未观察到显著差异（图9）。此外，我们对使用超速离心和TFF纯化sIONP玻璃化冷冻和纳米复温的肾脏进行了普鲁士蓝染色。如图S11（支持信息）所示，普鲁士蓝染色在肾皮质某些部分呈阳性，如肾小球丛和间质空间中，无论超速离心还是TFF纯化sIONP肾脏移植前后。虽然我们先前的工作将棕色残留物与sIONP-VS55加载/卸载后的sIONP沉积相关联，但本研究证明了生物相容性VMP-sIONP混合物的普鲁士蓝染色，用于超速离心和TFF纯化sIONP移植前后（图S11）。

结论

总之，我们展示了使用切向流过滤（TFF）方法纯化二氧化硅包被氧化铁纳米颗粒（sIONP）用于纳米复温。将纳米复温扩展至临床使用确实需要每个器官克级量的IONP。例如，一个人类肾脏，估计血管分数为25%，体积约200毫升，当以10毫克铁每毫升灌注IONP时，需要约500毫克铁（Fe）。这还不包括灌注所需的额外体积。如果美国每年用于移植的25,000个肾脏首先进行纳米复温，总IONP需求将达到每年约12.5千克。当考虑其他可移植器官（如肝脏和心脏，纳米复温也已尝试）时，这一要求大幅增加。传统纯化方法，如超速离心，由于吞吐量和操作限制，在这一规模下变得不切实际。相比之下，本工作中演示的切向流过滤（TFF）方法本质上是可扩展的，并与广泛的生产体积兼容。虽然我们当前的实验室规模纯化是在0.72克铁上进行的，但TFF系统通常用于生物处理中处理从毫升到几千升的体积。例如，商业平台如Sartoflow 4500通常处理200-2000升未过滤溶液，产生1至15千克过滤产品（例如IONP）。TFF与常规超速离心进行了评估，后者先前用于sIONP。结果显示，超速离心sIONP和TFF纯化sIONP在VMP或VS55中的稳定性、核心加热能力（从SAR值明显）、IONP暴露后HDF细胞存活率、DLS尺寸或sIONP的ζ电位方面无统计学显著差异。此外，sIONP灌注到大鼠肾脏中显示了超速离心sIONP和TFF纯化sIONP玻璃化冷冻和纳米复温的充分分布。此外，移植研究表明存活率和肾功能相当，超速离心sIONP和TFF纯化sIONP与对照组的血清肌酐水平在术后26天收敛。有趣的是，洗脱后所有IONP肾脏中均观察到棕色残留物（与先前研究一致），但TFF纯化与超速离心sIONP组相比显著减少。值得注意的是，TFF和超速离心IONP肾脏残留物在移植后26天（TFF纯化sIONP）和30天（超速离心sIONP）进一步减少，表明体内随时间自然消除。重要的是，在两种IONP案例中，剩余铁含量测量低于FDA允许水平。然而，观察到此剩余铁和组织学中潜在连接的棕色残留物表明有机会进一步优化IONP并进一步表征体内对这些IONP的反应。TFF相对于超速离心的显著优势显示为减少纯化时间（2小时30分钟 vs. 3天）、简单的可扩展路径（即不依赖于小瓶体积）、消除IONP损失、消除乙醇使用和减少劳动。进一步研究将解决超速离心和TFF纯化sIONP之间观察到的SAR值略有降低的问题，重点关注包被效率。最后，TFF显示了在不久的将来将纳米复温扩展至临床器官规模的潜力。