基于CytoFLEX Nano流式细胞仪的外泌体（Exosome）亚群分析：技术优化与应用前景探索

本文系统评估了CytoFLEX Nano流式细胞仪在外泌体（EVs）检测中的性能，通过与传统流式仪（CytoFLEX）对比，验证了其在纳米颗粒检测灵敏度、粒径分辨率和多参数标记（CD9/CD63/CD81）方面的优势，并探讨不同分离方法（超速离心、试剂盒法、EXODUS）对外泌体得率与标记效率的影响，为外泌体研究提供了重要的方法学支持与临床转化潜力。

　　

1 引言

外泌体是细胞外囊泡（EVs）的一种亚型，直径通常在30–150 nm之间，广泛分布于血液、尿液和唾液等体液中。自20世纪80年代被发现以来，外泌体因其在免疫调节、癌症进展和代谢性疾病中的重要作用而备受关注。作为蛋白质、脂质和核酸的载体，外泌体能够反映源细胞的生理或病理状态，是连接细胞内状态与外部微环境的关键桥梁。近年来，外泌体生物学的重要进展不仅深化了我们对细胞通讯和疾病机制的理解，也凸显了其作为疾病诊断、预后和监测的非侵入性生物标志物的潜力。

然而，将外泌体研究转化为临床应用的一个主要挑战在于准确分析外泌体亚群。新兴证据表明，外泌体在大小、膜蛋白丰度和差异货物负载方面存在异质性，这可能与特定疾病类型的进展相关，并影响细胞间信号传递和治疗反应。因此，优化外泌体亚群的分析技术对于增进我们对其潜在机制的理解和识别潜在生物标志物至关重要。

值得注意的是，作为研究外泌体相关治疗应用的第一步，从复杂生物基质中可靠、高效地分离外泌体是后续研究的基础。多种技术，如超速离心、尺寸排阻色谱、超滤、免疫亲和捕获和基于聚合物的沉淀等，已被开发用于外泌体的分离，每种方法都有其独特的优点和缺点。分离完成后，外泌体的表征和分析同样关键，其中流式细胞术已成为外泌体分析的强大工具。传统的外泌体表征通常包括使用透射电子显微镜（TEM）进行形态鉴定、通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）确定大小以及通过Western blotting鉴定表面蛋白标志物。尽管这些常规方法有助于我们了解EV生物学，但它们掩盖了单个颗粒的特征，限制了准确分析EV群体和亚群的能力。

目前，高灵敏度流式细胞术的发展，特别是针对亚微米颗粒的检测，使得外泌体的定量和多参数分析成为可能。然而，流式细胞术在外泌体检测中的应用仍面临挑战，如分辨率限制、背景噪声干扰以及缺乏标准化的检测方法。

2 材料与方法

2.1 样本制备

血液样本采集自延安大学咸阳医院，经伦理批准（YDXY-KY-2023-005）。凝血后离心取上清，快速冷冻并保存于-80°C。细胞培养上清样本来自MHCC 97L和iPS-hTERT细胞，使用添加10%去外泌体胎牛血清的DMEM或MEM培养基培养。

2.2 外泌体分离方法

采用三种方法分离外泌体：超速离心法、沉淀法（使用商业化试剂盒）和EXODUS自动化超滤法。超速离心法包括多次离心步骤和100,000×g超离；沉淀法基于试剂盒 protocol 进行过夜沉淀和离心；EXODUS方法则利用负压驱动纳滤和非对称流超滤原理实现快速纯化。

2.3 流式细胞仪设置与校准

使用CytoFLEX Nano流式细胞仪（Beckman Coulter）进行所有实验。每日进行质量控制，包括激光功率、液流速率、背景噪声、散射性能和荧光性能评估。使用500 nm 8Peaks荧光微球评估荧光灵敏度，使用40–1000 nm标准微球评估粒径准确性，使用NIST可追溯100 nm微球评估浓度测量线性。数据通过FCMPASS软件进行标准化散射光校准。

2.4 外泌体标记与检测

外泌体样品用FITC-CD9、PE-CD81和APC-CD63抗体标记，避光孵育1小时后进行流式检测。为验证囊泡结构，部分样本用0.5% Triton X-100处理破坏膜结构。

2.5 数据分析

所有数据通过CytoFLEX Nano和传统CytoFLEX流式细胞仪采集，使用FCMPass软件处理粒径分布数据。实验独立重复三次，数据以均值±标准误表示，使用Excel或GraphPad Prism 8.0进行统计分析。

3 结果

3.1 仪器性能校准

CytoFLEX Nano日常质控显示仪器背景噪声低（水样本检测率＜100 events/s），光学和荧光检测性能稳定，符合高灵敏度检测要求。

3.2 荧光检测灵敏度

使用500 nm 8Peaks微球校准显示，CytoFLEX Nano能清晰分辨8个荧光峰（V447、B531、Y595通道），在R670、R710和R792通道也可分辨6、5和4个峰，表现出优异的荧光分辨能力和信号一致性。

3.3 粒径检测准确性

VSSC1通道（40–200 nm）和VSSC2通道（80–1000 nm）检测显示，仪器可准确测量40–1000 nm标准微球，分辨率达20 nm。对于≥100 nm颗粒，测量重复性高，与标准值高度一致。

3.4 浓度定量分析

NIST可追溯100 nm微球经1000倍稀释后，CytoFLEX Nano测得浓度为1.804×10¹⁰ particles/mL，与理论值（1.809×10¹³ particles/mL稀释后）高度吻合（R²=0.9992）。传统CytoFLEX仪同样准确但线性稍低（R²=0.9878）。

3.5 不同来源外泌体的粒径与标记分析

超速离心法提取的iPS-hTERT-exo、MHCC 97L-exo和血清来源外泌体粒径分布各异。抗体标记效率分别为：CD9（3.76–28.97%）、CD81（1.61–17.39%）、CD63（2.97–20.68%）。Triton X-100处理后荧光信号下降，证实标记特异性。

3.6 分离方法对外泌体得率与标记的影响

EXODUS法得率最高，超速离心法最低；但超速离心法标记效率最高，EXODUS和试剂盒法较低，说明方法选择显著影响下游分析结果。

3.7 仪器对比：CytoFLEX Nano vs. CytoFLEX

CytoFLEX Nano可检测40–80 nm颗粒，而传统CytoFLEX检测下限为80 nm。在≥80 nm颗粒计数上两者一致，但CytoFLEX Nano在小颗粒检测和多重标记（尤其是CD81）方面灵敏度更高。

4 讨论

本研究全面评估了CytoFLEX Nano流式细胞仪在外泌体研究中的性能。结果表明，该仪器在检测灵敏度、粒径分辨率和多参数标记能力方面均优于传统流式细胞仪，尤其适用于40–150 nm的外泌体分析。不同分离方法对外泌体得率和标记效率有显著影响：超速离心法标记效率高但得率低，EXODUS法得率高但标记效率较低。这强调了下游分析中方法选择的重要性。

外泌体作为疾病生物标志物具有巨大潜力，尤其在肿瘤（如胰腺癌、肺癌）、神经退行性疾病和心血管疾病的早期诊断与监测中。CytoFLEX Nano平台的高分辨率检测能力有助于发现疾病特异性的外泌体亚群，推动液体活检技术的发展。

然而，流式检测仍存在一些局限，如高浓度下的“群集检测”现象、抗体标记效率变异以及样本纯度要求高等问题。未来需通过优化样本处理、标记策略和操作标准化来提高检测准确性与可重复性。

5 结论

CytoFLEX Nano流式细胞仪在外泌体检测中表现出高灵敏度、分辨率和重复性，是外泌体研究的强大工具。结合优化的分离与标记策略，该平台有望推动外泌体在基础研究、疾病诊断和临床应用中的广泛使用。