抑制甘油-3-磷酸磷酸酶与增强甘油-3-磷酸穿梭通量对快速生长产油Schizochytrium高效脂肪酸生产的关键作用

本综述系统阐述了通过抑制甘油-3-磷酸磷酸酶（G3PP）活性与增强甘油-3-磷酸（G3P）穿梭通量，显著提升裂殖壶菌（Schizochytrium）脂肪酸合成效率的分子机制与工程策略，为微生物油脂工业化生产提供了突破性解决方案。

　　

1 引言

脂肪酸作为可持续生物燃料和高价值营养补充剂（如ω-3多不饱和脂肪酸），在能源与健康领域具有重要应用。尽管微生物脂肪酸生产已取得显著进展，但低效价和低生产率仍是限制其工业化应用的关键瓶颈。异养微藻裂殖壶菌（Schizochytrium）因其快速生长、高效碳源同化和高脂质积累能力而成为理想底盘细胞。本研究通过多组学分析和定向工程改造，揭示了调控脂肪酸合成的关键机制，并构建了高效生产菌株。

2 结果

2.1 裂殖壶菌ZW1菌株的脂肪酸生产潜力评估

在5-L发酵罐中采用补料分批培养策略，ZW1菌株在68小时达到最大生物量92.18 ± 2.01 g L^?1，总脂肪酸（TFA）和甘油三酯（TAG）效价分别为41.15 ± 1.58 g L^?1和38.40 ± 3.92 g L^?1，生产率分别为0.61 ± 0.02 g L^?1 h^?1和0.56 ± 0.06 g L^?1 h^?1。该菌株展现出快速生长和高葡萄糖消耗能力，但其脂肪酸效价和生产率仍低于其他高产油微生物（如耶氏酵母和红酵母）。

2.2 通过诱变和定制化流式细胞术优化底盘细胞

为克服裂殖壶菌遗传工具缺乏的限制，研究采用常压室温等离子体（ARTP）诱变结合荧光激活细胞分选（FACS）策略进行定向进化。针对细胞聚集和染色效率低的问题，通过安装微型电机促进细胞解聚，并设计多步门控策略（P1: 全群体；P2: 完整单细胞；P3: 非聚集亚群；P4: 前1%荧光细胞）。经过六轮筛选，获得突变株ZW2，其生物量、TFA和TAG含量均显著提升。在摇瓶培养中，ZW2在60小时的TFA和TAG含量分别达到66.37%和54.38%，较ZW1提高1.40和1.43倍。在5-L发酵罐中，ZW2的生物量、TFA效价和生产率为111.78 ± 1.46 g L^?1、72.14 ± 1.38 g L^?1和1.06 ± 0.02 g L^?1 h^?1，较ZW1均有显著提升。

2.3 多组学分析揭示ZW2突变株的脂质合成新机制

通过基因组重测序、转录组学和代谢组学分析，发现ZW2中甘油-3-磷酸磷酸酶（G3PP）活性抑制和多不饱和脂肪酸合酶C亚基（ORFC）突变是关键遗传变异。分子对接和分子动力学模拟表明，G3PP第147位点突变（甘氨酸→天冬氨酸）引入了新的氢键，降低了结合能和分子间能，导致酶活性下降。酶活实验证实ZW2的G3PP活性显著低于ZW1，而甘油激酶活性上调，促进了甘油-3-磷酸（G3P）积累。此外，ORFC第273位点突变（异亮氨酸→缬氨酸）增强了多不饱和脂肪酸（PUFA）合成，在大肠杆菌异源表达体系中DHA和DPA含量提高1.77倍。

转录组分析显示，ZW2中脂肪酸合成（乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合酶）、G3P穿梭（甘油-3-磷酸脱氢酶GPD1/GPD2）和TAG合成（磷脂酸磷酸酶）相关基因显著上调，而部分脂质降解基因下调。代谢组学进一步证实糖酵解中间体（F6P、PEP、GAP）、G3P穿梭代谢物（DHAP、G3P）和脂肪酸前体（乙酰辅酶A）水平升高，表明中心碳代谢和脂质合成通量增强。

2.4 理性工程重构ZW2的高效表型

基于G3P穿梭通量增加和G3P降解抑制的机制，研究在ZW1中共过表达gpd1和gpd2基因（菌株ZW1 G1G2-1），并添加G3PP抑制剂CP1。该组合策略使TFA效价和生产率达到ZW2的80%，验证了G3P穿梭调控的核心作用。发酵性能显示，ZW1 G1G2-1的TFA效价和生产率分别为52.01 ± 1.11 g L^?1和0.76 ± 0.02 g L^?1 h^?1，较ZW1显著提升。

2.5 工程化ZW2实现更高脂肪酸生产率

在ZW2背景中过表达TAG合成关键基因二酰甘油酰转移酶（dgat）和长链酰基辅酶A合成酶（lcas），获得工程菌ZW2-D-L2。在5-L发酵罐中，该菌株生物量达122.64 ± 5.05 g L^?1，TFA和TAG效价分别为94.65 ± 1.29 g L^?1和88.51 ± 5.38 g L^?1，生产率分别为1.39 ± 0.02 g L^?1 h^?1和1.30 ± 0.08 g L^?1 h^?1，较ZW1提高2.30倍和2.32倍。BODIPY染色显示ZW2-D-L2细胞中脂滴几乎充满整个细胞，细胞尺寸显著增大。稳定性测试表明该菌株遗传和表型性状稳定，具备工业化应用潜力。

3 讨论

本研究通过整合发酵优化、随机诱变、高通量筛选和多组学分析，建立了高效的裂殖壶菌工程平台。关键发现包括：

1. 1.

   G3PP活性抑制通过减少G3P水解，增强TAG合成前体供应；

2. 2.

   G3P穿梭通量增加协调了细胞生长和脂质合成的碳流分配；

3. 3.

   ORFC突变提升了PUFA合成效率。

   与传统策略（如耶氏酵母的氧化还原工程）相比，该研究提供了针对碳中心代谢的新调控视角。经济性分析表明，ZW2-D-L2的脂肪酸生产成本较其他底盘微生物降低10.79–16.95%，且生产周期缩短16–28小时，具备显著工业化优势。

4 结论

本研究开发了高效产油裂殖壶菌菌株ZW2-D-L2，其TFA和TAG效价分别达94.65 g L^?1和88.51 g L^?1，生产率分别为1.39 g L^?1 h^?1和1.30 g L^?1 h^?1，性能超越已报道所有微生物系统。研究揭示了G3P代谢调控的核心作用，建立了“菌株优化-机制解析-遗传工程”的研究范式，为微藻生物技术产业化提供了突破性解决方案。