线粒体定位的Nestin通过维持嵴结构功能延缓间充质干细胞衰老的新机制

本研究发现中间丝蛋白Nestin通过线粒体靶向序列（MTS）经TOM20机制定位于线粒体膜间隙（IMS），通过与Mic60相互作用稳定线粒体嵴结构，维持氧化磷酸化（OXPHOS）功能。Nestin缺失导致嵴结构紊乱、呼吸链复合物表达下降、ATP生成减少，最终引发hMSCs衰老。该研究揭示了Nestin在线粒体质量控制中的非经典功能，为衰老相关疾病提供了新的干预策略。

　　

1 引言

中间丝蛋白（IFs）在真核细胞中形成动态结构网络，通过调节细胞形状和行为驱动关键细胞过程。Nestin作为VI型IFs蛋白，在神经干细胞、间充质干细胞等多种干细胞中表达，近年来被发现具有细胞质外的非经典功能。先前研究表明Nestin与线粒体共定位，其缺失会改变线粒体功能，包括耗氧率和ATP生成，并在干细胞分化过程中引发线粒体形态重塑。然而，Nestin动态定位变化与其调节线粒体功能之间的关系尚不清楚。

2 结果

2.1 Nestin定位于hMSCs线粒体膜间隙

通过免疫荧光标记发现Nestin与线粒体外膜转位酶20（TOM20）明显共定位。免疫金电子显微镜显示Nestin抗体结合的金颗粒位于线粒体内部。亚细胞分离实验在线粒体组分中检测到Nestin蛋白。蛋白酶K保护实验表明，Nestin能抵抗蛋白酶K单独处理，但在Triton X-100完全破坏线粒体结构后被降解，提示Nestin位于线粒体内部而非外膜。进一步实验证实Nestin位于线粒体膜间隙（IMS），稀疏结构光照明显微镜（Sparse-SIM）观察显示Nestin定位于线粒体内外膜之间。

2.2 Nestin线粒体转位依赖其靶向序列和TOM20机制

生物信息学分析发现人类和小鼠Nestin氨基末端存在线粒体靶向序列（MTS）和TOM20识别 motif（TRM）。构建GFP融合过表达载体实验表明，缺失MTS、TRM或双缺失突变体均显著降低Nestin的线粒体定位。TOM20敲低显著损害Nestin的线粒体转位，共聚焦显微镜观察显示TOM20敲低细胞中Nestin线粒体定位明显减少。这些发现表明Nestin的线粒体转位需要MTS和TRM与TOM20的协同作用。

2.3 线粒体Nestin缺失导致线粒体形态和功能异常

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统建立Nestin敲除（NES KO）人诱导多能干细胞（hiPSCs），并通过 established hiPSCs-neuro mesodermal progenitors (NMP)-MSCs分化协议生成野生型（WT）和NES KO hMSCs。Confocal显微镜观察发现Nestin缺失导致线粒体结构紊乱，从管状线粒体转变为肿胀的囊泡状结构。Seahorse细胞能量代谢分析显示Nestin缺失显著降低氧化磷酸化（OXPHOS）水平。线粒体Nestin（mito-Nestin）缺失导致线粒体ATP产生减少和NAD⁺/NADH比率降低。Nestin敲除特异性影响线粒体编码亚基（NDUFB8、UQCRC2、COX2和ATP5）的mRNA表达，但不改变核编码SDHB的mRNA表达。此外，Nestin敲除导致这些电子传递链（ETC）复合物亚基蛋白水平显著降低，与线粒体DNA（mtDNA）含量减少相关。还观察到线粒体活性氧（mtROS）大量积累、线粒体膜电位下降和线粒体自噬增加。

过表达全长Nestin（NES KO + Nestin^Full）和MTS缺陷型Nestin（NES KO + Nestin^ΔMTS）实验表明，全长Nestin过表达恢复线粒体形态，而mito-Nestin缺陷型hMSCs未能挽救正常线粒体网络。线粒体动力学分析显示mito-Nestin缺陷型hMSCs中关键融合蛋白显著减少，包括MFN2表达降低和视神经萎缩蛋白1（OPA1）长（L）/短（S）亚型比率降低。对于分裂调节，NES KO hMSCs中Drp1磷酸化（线粒体分裂标志物）减少。总Drp1或Fis1表达未见显著变化。

2.4 Nestin缺失破坏线粒体嵴稳态

透射电子显微镜（TEM）观察显示Nestin敲除导致hMSCs线粒体内膜结构紊乱，嵴数量减少，内膜表面积显著减少。全长Nestin过表达可有效挽救这些异常，但MTS缺陷型Nestin突变体不能。基于电镜数据对线粒体嵴关键形态指标分析表明，mito-Nestin缺失显著破坏嵴形态和结构。hMSCs分离线粒体的蛋白质分析显示，mito-Nestin缺失后OPA1 L/S亚型比率和关键MICOS组分Mic60和Mic19降低。共聚焦显微镜显示Nestin缺陷型线粒体中OPA1、Mic60和Mic19蛋白的互连性减少和空间分布紊乱。蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）分析显示，与对照组相比，mito-Nestin缺陷型hMSCs中Mic60/Mic19包含复合物 destabilized。

2.5 Nestin通过与Mic60相互作用维持线粒体嵴结构和功能

邻近连接 assay（PLA）和免疫共沉淀实验证实Nestin与Mic60相互作用。结构预测显示Nestin通过其Tail结构域（1390aa-1450aa区域）识别Mic60。免疫共沉淀实验证明Mic60主要与Nestin的Rod+Tail3蛋白片段结合，表明Nestin通过其Tail3结构域与Mic60相互作用来稳定MICOS复合物。在NES KO hMSCs中过表达Rod结构域和Rod+Tail3蛋白片段，BN-PAGE分析显示Nestin与Mic60接触减少导致Mic60/Mic19包含复合物减少。TEM观察显示Rod+Tail3片段过表达有效挽救mito-Nestin缺失引起的线粒体内膜损伤。线粒体嵴形态分析表明Rod+Tail3片段过表达恢复破坏的嵴结构。能量代谢变化分析显示，与NES KO组相比，Rod+Tail3片段过表达显著增强hMSCs线粒体OXPHOS水平，同时增加线粒体ATP产生和NAD⁺/NADH比率。

进一步机制研究发现，mito-Nestin缺失不显著影响Mic60转录，但通过 cycloheximide（CHX） chase assays 发现破坏其与Nestin相互作用后Mic60降解显著加速。使用蛋白酶体抑制剂MG132和靶向敲低线粒体蛋白酶（YME1L、LONP1）发现，只有YME1L耗竭显著逆转Nestin缺陷型hMSCs中Mic60降解。免疫共沉淀验证Nestin与Mic60结合竞争性抑制YME1L-Mic60相互作用。

2.6 线粒体Nestin缺失加速hMSCs衰老

NES KO hMSCs与WT hMSCs相比增殖能力降低，表现为早期生长停滞、S期细胞百分比减少、克隆扩张能力受损和Ki67阳性细胞减少。NES KO hMSCs表现出加速衰老，SA-β-gal阳性细胞比例增加、衰老相关分泌表型（SASP）因子（IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1）上调和衰老标志物（包括CDKN2A（p16）和DNA损伤标志物如γH2AX）表达升高。Western blot和免疫荧光染色发现衰老hMSCs中Nestin表达显著降低。体内实验使用PDGFRα-creER;Rosa26-CAG-tdTomato报告小鼠发现，与年轻（2月龄）对照组相比，老年（24月龄）小鼠PDGFRα⁺ BMMSCs中mito-Nestin共定位减少，在DNA损伤标志物γH2AX阳性的PDGFRα⁺细胞中尤为明显。

在NES KO hMSCs中使用慢病毒过表达载体过表达全长Nestin、MTS缺陷型Nestin或Nestin的Rod结构域和Rod+Tail3结构域并检测细胞衰老，发现mito-Nestin缺失显著增加SA-β-gal阳性细胞、减少Ki67表达、上调p16水平和诱导DNA损伤。mito-Nestin缺陷型hMSCs中SASP因子表达显著升高。Rod+Tail3蛋白片段过表达而非单独Rod结构域有效减轻NES KO hMSCs细胞衰老。

机制上，mito-Nestin缺陷导致细胞内ROS积累和mtROS产生增加，同时激活p53-p21信号轴。用mtROS清除剂MitoTEMPO处理部分挽救mito-Nestin缺失hMSCs的衰老表型。同时，mito-Nestin缺失引发mtDNA释放到细胞质中，导致更高水平的cGAS–STING激活，表现为pTBK1（S172）、pSTING（S365）水平显著升高和随后SASP诱导。使用VDAC抑制剂VBIT-4抑制mtDNA释放部分减弱hMSCs衰老。

3 结论

本研究揭示Nestin通过其MTS和TOM20导入机制定位于线粒体IMS。在线粒体内，Nestin通过其C末端Tail3结构域与MICOS关键组分Mic60相互作用。这种相互作用对于维持嵴完整性至关重要，是支持OXPHOS和整体线粒体功能所必需的。mito-Nestin缺失破坏嵴结构，导致线粒体肿胀、生物能量功能障碍并最终导致hMSCs衰老。这些发现强调了mito-Nestin在保持线粒体结构和功能中的关键作用，突出了其在维持MSCs再生能力和 longevity 方面的重要性。