一种基于福尔马林固定长期存储根尖压片技术高效检测染色体/核蛋白与重复DNA的新型免疫方案

本研究针对植物大染色体免疫检测中存在的染色体聚集、形态不佳、非特异性荧光及免疫反应性不足等问题，开发了一种基于福尔马林固定、乙醇长期保存根尖样本的改良压片技术。通过微波抗原修复（MWAR）和蛋白重检测等创新步骤，实现了高质量染色体/核蛋白免疫标记与荧光原位杂交（FISH）的高效结合，为植物细胞表观遗传学研究提供了灵活可靠的技术平台。

　　

在植物基因组研究领域，了解染色体和间期核中蛋白质的空间分布及其与DNA的相互作用至关重要。然而，传统的免疫检测方法面临诸多挑战：使用中性缓冲多聚甲醛（NBPFA）固定的大染色体在压片过程中容易出现染色体聚集、形态不佳的问题；非特异性荧光背景干扰严重；免疫反应性不足；且难以与荧光原位杂交（FISH）有效结合。更令人困扰的是，从材料采集到检测前处理的整个流程必须在短时间内完成，通常只有一天时间，这给研究工作带来了很大不便。

为了解决这些技术难题，Hieronim Golczyk在《Plant Methods》杂志上发表了一项创新性研究，开发了一种简单高效的压片技术方案。该方案专门针对经过甲醛固定的大型植物染色体/细胞核（如葱属、绵枣儿属、紫露草属），实现了固定根尖和玻片标本的长期存储，能够获得高质量免疫标记的中期板/核铺片，几乎无非特异性荧光，并能进行灵敏的免疫FISH核型分析。

研究人员采用的主要技术方法包括：使用10%缓冲福尔马林（NBF）固定根尖，70%乙醇中长期保存固定组织，柠檬酸盐缓冲液中的果胶酶-纤维素酶混合消化，45%乙酸中适度压片，玻片冷冻后乙醇辅助细胞粘附，甘油中保存标本，以及一到两个周期的微波抗原修复（MWAR）。这些技术的结合应用确保了优异的染色体/核铺片效果、良好的细胞玻片粘附性、有效的抗原修复、减少/消除非特异性荧光，并改善了抗体渗透性。

材料与方法部分详细描述了实验设计：研究使用洋葱(Allium cepa)、绵枣儿(Scilla campanulata)和紫露草(Tradescantia spathacea)作为模式植物，取其根尖经过α-溴萘预处理抑制纺锤体形成，然后用NBF或NBPFA固定。固定后的根尖可在70%乙醇中长期保存，经过酶解软化后在45%乙酸中压片，制备的玻片可在甘油中冷藏保存数月而不影响后续实验效果。

结果与讨论部分展示了该技术的显著优势：NBF固定结合乙醇存储的方案产生了特别高质量的染色体铺片，中期染色体重叠极少，染色体形态清晰。通过MWAR处理，免疫信号强度得到显著增强，非特异性荧光背景大大降低。研究人员成功检测了核仁蛋白 fibrillarin (FBL) 和组蛋白H3第10位丝氨酸磷酸化 (H3S10ph) 这两种重要蛋白的分布。

特别令人印象深刻的是，该技术实现了高质量的免疫FISH实验，能够同时可视化FISH信号和蛋白焦点。以紫露草为例，研究人员使用45S rDNA探针成功标记了10个亚端粒rDNA簇和难以检测的着丝粒周边rDNA残余序列，同时清晰显示了H3S10ph的着丝粒周边信号，证明了该技术在表观FISH核型分析中的高度灵敏性。

创新性步骤是该研究的核心价值所在：使用中性缓冲福尔马林（NBF）作为固定剂，相比传统的NBPFA固定，不仅制备简便，更重要的是显著改善了染色体铺片质量；固定材料可在乙醇中长期保存，制备的玻片可在甘油中存储，大大增加了实验安排的灵活性；在45%乙酸中压片，改善了细胞扁平度和铺展效果；微波抗原修复（MWAR）的应用增强了免疫反应性，减少非特异性荧光；蛋白重检测功能允许对同一标本进行多次免疫标记，增强了信号强度；免疫FISH技术支持DNA和蛋白的同时可视化检测。

技术优势表现在多个方面：该协议避免了额外的化学透化步骤，却能有效促进抗体和FISH探针穿透细胞壁和细胞质；适用于大型染色体研究，同时保持清晰的免疫信号和令人满意的背景对比度；允许长期保存固定植物组织和进行表位重检测以增强信号强度；为实验室工作提供了前所未有的灵活性。

结论部分强调：这种MWAR辅助的方案能够产生特别高质量的压片免疫标记中期板，同时提供优良的核铺片和适当的免疫染色核。它包括一系列在染色体免疫方案中未描述的步骤和选项，如使用中性缓冲福尔马林固定、根尖乙醇存储、乙酸压片、MWAR、蛋白重检测以及免疫FISH辅助的同步DNA-蛋白可视化。本文描述的灵敏免疫FISH技术可用于高级表观FISH核型分析。该方案的价值和实用性还在于能够长期保存固定植物组织和进行表位重检测以增强信号强度。最终，它为实验室工作提供了前所未有的灵活性。

这项研究开发的创新技术方案解决了植物细胞遗传学研究中长期存在的技术难题，为研究染色质相关蛋白在染色体和核型进化中的作用提供了强有力的工具，特别适用于具有大基因组的植物物种。通过提高免疫检测的可靠性和与FISH结合的有效性，该技术将显著促进植物比较表观基因组学的研究进展。