5-氮杂胞苷通过第一内含子去甲基化调控髓系白血病细胞基因表达及治疗机制研究

本研究针对5-氮杂胞苷（5-Aza）在髓系白血病治疗中关键靶基因不明确的问题，通过RNA测序和长读长测序技术，系统分析了5-Aza处理后细胞基因表达和DNA甲基化变化，发现43个基因因第一内含子去甲基化而表达上调，其中HDC和MICALL2高表达预示更好预后，而BTG2等6个基因与不良预后相关，为开发5-Aza联合疗法提供了新靶点和理论依据。

　　

在血液系统恶性肿瘤中，急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合征（MDS）是由于造血干细胞累积遗传和表观遗传异常导致的克隆性疾病。5-氮杂胞苷（5-Azacitidine, 5-Aza）作为一种去甲基化药物，已在临床中显示出对MDS和AML的治疗效果，但其介导细胞杀伤作用的具体基因机制尚不明确。以往研究多聚焦于启动子区域甲基化对基因沉默的影响，而近年来发现第一内含子（intron 1）的甲基化状态同样与基因转录调控密切相关，但在髓系恶性肿瘤中的作用及相关研究仍较为有限。因此，探究5-Aza是否通过影响第一内含子的甲基化状态从而调控基因表达，对阐明其治疗机制和开发新的联合治疗策略具有重要意义。

本研究由Machiko Fujioka等人开展，论文发表在《Leukemia Research》上。研究人员为探究5-Aza在髓系白血病细胞中通过DNA去甲基化介导基因表达变化的机制，采用了以下关键技术方法：使用SKM-1（MDS/AML来源）和KG-1a（AML来源）细胞系，通过细胞活力实验确定5-Aza的IC₂₅和IC₅₀浓度；利用RNA测序（RNA-seq）技术分析5-Aza处理后的基因表达变化；采用纳米孔长读长测序（PromethION, Oxford Nanopore Technologies）检测全基因组DNA甲基化状态，特别是启动子和第一内含子区域；通过生物信息学方法（包括edgeR、methylKit等）进行差异表达和差异甲基化分析；利用TCGA-AML数据库（来自BloodSpot平台）进行生存分析，评估基因表达与预后的关系。

3.1. 确定5-Aza对细胞活力影响较小的浓度

通过细胞活力实验，研究人员确定了5-Aza在SKM-1和KG-1a细胞中的IC₂₅值分别为250.0 nM和220.0 nM，IC₅₀值分别为742.1 nM和666.2 nM。选择IC₂₅浓度进行后续实验，以观察早期表观遗传变化介导的基因表达效应。

3.2. 鉴定5-Aza处理后髓系白血病细胞中的差异表达基因

RNA-seq分析显示，在SKM-1和KG-1a细胞中，5-Aza处理分别导致537和748个基因表达差异（包括上调和下调）。其中，两组细胞系共同上调的基因有54个。这些基因富集在“DNA损伤反应”、“中性粒细胞脱颗粒”和“氨基酸代谢”等通路。

3.3. 通过长读长测序鉴定5-Aza处理后的DNA甲基化谱

利用纳米孔长读长测序技术，研究人员发现5-Aza处理后全基因组甲基化水平显著降低。进一步分析显示，在启动子区域和第一内含子区域均存在去甲基化基因。其中，79个基因在第一内含子区域呈现显著去甲基化，且这些基因同样富集于“DNA损伤反应”、“中性粒细胞脱颗粒”和“氨基酸代谢”通路。

3.4. 鉴定第一内含子DNA甲基化状态与基因转录相关的基因

研究人员将54个共同上调基因与79个第一内含子去甲基化基因进行交集分析，发现43个基因在第一内含子去甲基化的同时表达上调。与此相比，启动子区域去甲基化仅与1个基因（MGAT3）的表达上调相关。这表明第一内含子去甲基化在5-Aza介导的基因表达调控中起主要作用。

3.5. 5-Aza调控的基因与AML预后的关联

通过TCGA-AML数据库的生存分析，发现两个基因（HDC和MICALL2）的高表达与更好的总生存期显著相关，而六个基因（BTG2、CD52、PECAM1、PIK3IP1、PTGS2和TREML2）的高表达与更差的总生存期相关。例如，HDC基因在启动子和第一内含子区域均发生去甲基化，而MICALL2仅在第一内含子区域去甲基化。

本研究系统阐明了5-Aza通过诱导第一内含子去甲基化上调基因表达的机制，并鉴定出多个与AML预后相关的关键基因。其中，HDC和MICALL2作为潜在有利预后标志物，而TREML2等基因可能与5-Aza疗效抵抗相关。这些发现不仅深化了对5-Aza作用机制的理解，而且为开发新的联合治疗策略（如针对TREML2的靶向治疗）提供了重要理论依据和实验基础。此外，研究中所采用的长读长测序技术为全面解析DNA甲基化状态提供了新方法，未来可进一步在原发性AML/MDS样本中验证这些结果，并探索通过CRISPR/Cas9等技术验证这些基因在5-Aza敏感性中的功能。