工程化合成Notch激动剂：通过靶向内化机制实现机械力依赖的信号激活新策略

Notch信号通路在细胞命运决定中具有重要作用，但其机械力依赖的激活机制限制了可溶性激动剂的开发。本研究通过将亲和力成熟的Notch配体DeltaMAX与靶向内化蛋白偶联，设计了双特异性合成Notch激动剂（SNAGs），可特异性激活PDL1、CD19、HER2等肿瘤抗原靶点，增强T细胞抗肿瘤功能，为Notch信号调控提供了新型工具。

　　

Notch信号通路是进化上高度保守的细胞间通讯系统，在胚胎发育、组织稳态和免疫细胞分化中发挥核心调控作用。该通路的异常激活或抑制与多种人类疾病密切相关，包括主动脉瓣疾病（Notch1突变）、Alagille综合征（Notch2/JAG1突变）、CADASIL（Notch3突变）和脊柱肋骨发育不良（DLL3突变）。在肿瘤领域，Notch扮演着"双面刃"角色——既是肿瘤抑制因子又是癌基因，这种上下文依赖性功能使得其 therapeutic modulation 极具挑战性。

传统Notch抑制剂已有多种类型，但可溶性激动剂的开发始终面临根本性难题：Notch受体的激活需要机械拉力作用，当配体与受体结合后，配体的内化过程会产生物理拉力，进而破坏Notch负调控区（NRR）的构象，暴露蛋白酶切割位点，最终导致Notch细胞内结构域（NICD）的释放和核转位。这种独特的机械力驱动机制使得常规可溶性蛋白难以模拟天然激活过程。

为解决这一难题，Vincent C. Luca团队在《Nature Chemical Biology》发表了创新性研究成果。研究人员通过巧妙的分子工程设计，将亲和力成熟的Notch配体Delta^MAX（对Notch受体的亲和力提高500-1000倍）与能够介导靶标内化的抗体片段融合，开发出双特异性合成Notch激动剂（SNAGs）。这种"分子桥"设计使SNAGs能够同时结合Notch受体和特定细胞表面生物标志物，通过模拟天然配体的内化机制产生机械拉力，从而实现靶向性的Notch激活。

研究采用的关键技术方法包括：蛋白质工程（构建单体/二聚体SNAGs融合蛋白）、荧光报告基因系统（Notch1-Gal4 mCitrine reporter）、流式细胞术（信号激活定量）、免疫荧光显微术（内化过程可视化）、Western blot（NICD切割检测）以及原代T细胞共培养模型（免疫功能评估）。实验使用了多种工程细胞系（HEK293T、CHO-K1、MDA-MB-231等）和原代人CD8⁺ T细胞。

SNAGs挽救信号缺陷型DLL4突变体的功能

研究人员首先构建了缺失Notch结合结构域（C2-DSL）的"无头"DLL4突变体（DLL4^HL），该突变体完全丧失激活能力。通过将Delta^MAX与靶向BC2表位的纳米抗体融合，开发的BC2-SNAGs在共培养实验中成功恢复了Notch1信号传导，二聚体形式的BC2-SNAG^Fc效果尤佳，可诱导10倍的信号增强。重要的是，单独使用SNAGs而不存在靶细胞时无法激活信号，证实了其双细胞依赖的特性。

SNAGs增强弱信号JAG1配体的活性

JAG1是Notch1的弱激活剂，研究人员开发了靶向JAG1的SNAG（JAG1-SNAG^Fc）。实验表明，JAG1-SNAG^Fc可使JAG1过表达细胞系的Notch1信号提高4倍。针对引起Alagille综合征的JAG1-H268Q"nodder"突变体，SNAG处理更使信号增强达7倍，证明其作为"信号增强剂"的潜力。

靶向肿瘤抗原的SNAGs在混合细胞群中激活Notch

研究团队进一步开发了靶向PDL1、CD19和HER2肿瘤抗原的SNAGs。值得注意的是，单体PDL1-SNAG效果不佳，但二聚体PDL1-SNAG^Fc在共培养中诱导了7倍信号增强。CD19-SNAG^Fc和HER2-SNAG^Fc也分别在与相应靶标细胞共培养时表现出6倍激活效果。使用野生型DLL4（亲和力低1000倍）构建的SNAG完全无效，证明高亲和力结合至关重要。

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内吞作用是SNAG介导的Notch激活所必需的

通过免疫荧光和内吞抑制剂Dynasore实验，研究人员证实CD19-SNAG^Fc可被CD19⁺细胞内化，且这一过程是信号激活的必要条件。Dynasore处理完全 abolished SNAG介导的Notch激活，甚至固定化配体的激活也依赖内吞作用，揭示了机械力产生的细胞生物学基础。

SNAGs刺激T细胞活化标志物表达

在原代人CD8⁺ T细胞与肿瘤细胞共培养模型中，PDL1-SNAG^Fc和HER2-SNAG^Fc处理显著增加了颗粒酶B（GrB）阳性T细胞比例。转录水平上，GZMB、IFNG和HES4表达分别上调18倍/4倍、37倍/52倍和3倍/16倍，蛋白水平也验证了GrB和IFNγ的增加，表明SNAGs能增强T细胞效应功能。

研究结论表明，SNAG平台成功解决了可溶性Notch激动剂开发的长期挑战，提供了一种模块化、多功能的设计框架。这些新型生物制剂不仅能够增强内源性配体功能，还能实现针对特定细胞类型的精准Notch激活，在肿瘤免疫治疗、T细胞制造、组织再生等领域具有广阔应用前景。

值得注意的是，SNAGs在同时表达Notch和靶抗原的细胞上无法激活信号，这种"单向信号"特性可能减少全身性Notch激活的潜在毒性。然而，Notch受体在多种免疫细胞中的广泛表达仍需要进一步优化以提高靶向特异性。

该研究不仅推进了Notch信号调控的理解，更为机械敏感受体的药理激活提供了普适性策略，标志着Notch生物学和生物技术应用进入了一个新阶段。