探索TLR2、TLR4和TLR21激动剂组合在调节鸡免疫反应中的协同作用潜力

《Next Research》：Exploring the Synergistic Potential of TLR2, TLR4, and TLR21 Agonist Combinations in Modulating Chicken Immune Responses

鸡外周血单核细胞（PBMCs）及脾脏中，Pam3CSK4（TLR2激动剂）与LPS（TLR4激动剂）或CpG ODN（TLR21激动剂）联合刺激可显著上调IL-1β、Th1/Th2细胞因子（IL-12p40、IFN-γ、IL-4、IL-13）、IL-10、IFN-β及iNOS基因表达，并增强血清NO生成。体内实验显示，联合刺激使脾脏中上述免疫指标更显著，其中Pam3CSK4+LPS组合额外诱导IFN-β和NO生成。该协同效应为禽类疫苗佐剂开发提供了新思路。

　　

帕特尔·尼昆杰·库马尔·普拉卡什拜（Patel Nikunj Kumar Prakashbhai）| 萨拉瓦南·拉玛克里希南（Saravanan Ramakrishnan）| 迪普蒂·卡帕拉（Deepthi Kappala）| 阿比纳亚·卡利亚潘（Abinaya Kaliappan）| 库什布·潘瓦尔（Khushboo Panwar）| 杜马拉·纳维恩（Dumala Naveen）| 米蒂莱什·辛格（Mithilesh Singh）| 索希尼·德伊（Sohini Dey）| 马德汉·莫汉·切拉帕（Madhan Mohan Chellappa）

禽类免疫学实验室，免疫学部门

摘要

为了减少毒性并在较低剂量下获得所需的免疫反应，人们尝试组合使用Toll样受体（TLR）激动剂。本研究探讨了Toll样受体（TLR）激动剂的联合使用效果，重点关注鸡体内TLR2与TLR4或TLR21之间的相互作用。我们研究了Pam3CSK4（TLR2激动剂）与脂多糖（LPS，TLR4激动剂）或CpG ODN（TLR21激动剂）共同刺激鸡外周血单核细胞（PBMCs）的免疫反应，并在体内进行了验证。Pam3CSK4与LPS的联合使用显著上调了IL-1β的表达，并协同增强了Th1/Th2细胞因子（IL-12p40、IFN-γ、IL-4、IL-13）、IL-10、IFN-β和iNOS基因的表达以及一氧化氮（NO）的生成。同样，Pam3CSK4与CpG ODN的组合也增强了IL-1β和Th1/Th2细胞因子的表达，但对IFN-β和NO生成的促进作用较弱。体内实验表明，Pam3CSK4与LPS或CpG ODN的联合使用协同增强了脾脏中Th1/Th2细胞因子和iNOS基因的表达，并显著增加了IL-1β和MHC-II的表达。值得注意的是，Pam3CSK4与LPS的组合还显著诱导了脾脏中IFN-β的表达并增加了血清中的一氧化氮（NO）生成，而这些效果在Pam3CSK4与CpG ODN的组合中并未观察到。总体而言，我们的发现突显了这些TLR激动剂组合在增强鸡Th1/Th2细胞因子反应方面的强大协同作用，表明它们作为家禽疾病疫苗佐剂或免疫治疗剂的潜力。需要进一步的研究来阐明这种协同作用的机制，以开发更精准有效的免疫干预措施。

引言

免疫细胞可以通过其表达的Toll样受体（TLRs）被激活，从而产生多种趋化因子、细胞因子和干扰素（IFNs），并表达促进先天免疫反应的共刺激分子[37]。TLR激活后的下游信号传导还能促使抗原呈递细胞的功能成熟，使其能够更有效地与适应性免疫细胞相互作用，从而成为先天免疫系统和适应性免疫系统之间的关键桥梁，也是宿主免疫调节的有希望的目标[9,24]。TLRs主要参与识别称为病原体相关分子模式（PAMPs）的保守微生物/病原体结构。在感染过程中，TLRs识别病原体携带的特定PAMPs组合，激活多种免疫途径，共同产生消除感染所需的免疫反应。因此，通过不同PAMPs的组合策略性地激活多个TLRs，推动了现代疫苗中更好的免疫刺激剂和佐剂的发展[51]。天然或合成优化的PAMPs被用作配体或激动剂来激活特定的TLRs。然而，单一激动剂并不总是像多个TLRs那样能有效地引发免疫反应。在现代疫苗中，使用双重或多TLR激动剂作为免疫刺激剂或佐剂正受到越来越多的关注。许多研究表明，某些TLR激动剂的组合可以在鸡体内诱导出协同的免疫反应[7,16,19,29,32,40]。

在鸡体内，识别细菌PAMPs的主要TLRs是TLR2、TLR4、TLR5和TLR21[53]。病原体的细胞壁成分主要通过TLR2（识别三酰化和二酰化脂肽）和TLR4（检测脂多糖（LPS）来刺激免疫细胞。内吞体中的TLR21能识别微生物DNA中的未甲基化CpG序列，其功能类似于哺乳动物的TLR9[27]。TLR2激动剂Pam3CSK4已被证明能激活鸡体内的多种免疫和非免疫细胞，导致多种细胞因子的表达，包括IL-1β、IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-10[3,45,46]。LPS通过诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的生成，在鸡体内释放炎症细胞因子、某些趋化因子和气态自由基一氧化氮（NO）[2,28]。TLR21激动剂合成CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODN）已被证明能诱导促炎细胞因子和其他免疫基因的表达[12,48]。尽管这些激动剂（Pam3CSK4、LPS和CpG ODN）在鸡体内的免疫调节作用已得到充分研究，但其联合刺激效应尚未得到充分探讨。此外，研究TLR2与TLR4或TLR21的联合刺激所引发的免疫激活有助于我们理解鸡的细菌致病机制，并探索这些激动剂组合作为疫苗佐剂或独立治疗禽类疾病的潜力。因此，在本研究中，我们检测了Pam3CSK4与LPS或CpG ODN在体外（使用外周血单核细胞）和体内（在脾脏中）对鸡免疫反应的协同刺激效果。我们观察到，TLR2和TLR4或TLR2和TLR21分别与各自的激动剂同时激活时，比单一激动剂更能有效刺激免疫反应，表现为多种免疫反应基因表达和一氧化氮（NO）生成的增强。

实验鸟类和TLR激动剂

特定的无特定病原体（SPF）白来航鸡蛋从印度浦那的Venky's India私人有限公司购买，并在印度伊扎特纳加尔的中央禽类研究所孵化。这些鸟类按照标准管理措施进行饲养，提供充足的高压灭菌饲料和水。实验获得了印度伊扎特纳加尔印度兽医研究所动物伦理委员会（IAEC）的批准（批准函编号：F.26-1/2018-19/J.D，日期：5

使用单独激动剂及Pam3CSK4 + LPS和Pam3CSK4 + CpG ODN联合刺激后，鸡外周血单核细胞（PBMCs）中各种免疫基因的表达谱

Pam3CSK4或LPS或CpG ODN的刺激上调了鸡PBMCs中IL-1β、IFN-β、IL-12p40、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-10、iNOS和MHC-II基因的表达。

讨论

同时激活多个TLRs可以产生协同或调节性的免疫反应，这种策略可用于定制针对特定病原体的免疫反应，以开发疫苗、佐剂或抗菌剂[9]。在本研究中，我们通过检测多种免疫基因的表达模式，强调了将TLR2激动剂Pam3CSK4与TLR4激动剂LPS或TLR21激动剂CpG ODN联合使用的免疫刺激效果。

CRediT作者贡献声明

帕特尔·尼昆杰·库马尔·普拉卡什拜（Patel Nikunj Kumar Prakashbhai）：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，方法学设计，数据分析，概念构思。 萨拉瓦南·拉玛克里希南（Saravanan Ramakrishnan）：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，验证，监督，软件使用，资源管理，方法学设计，研究实施，资金获取，数据分析，概念构思。 迪普蒂·卡帕拉（Deepthi Kappala）：初稿撰写，方法学设计，数据管理。 阿比纳亚·卡利亚潘（Abinaya Kaliappan）：撰写 – 审稿与编辑

写作过程中未使用任何人工智能工具

在准备本工作时，作者们没有使用任何人工智能工具。

作者利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢印度兽医研究所所长提供的研究设施。本工作得到了印度科技部生物技术部的研究资助（项目编号：BT/PR15618/ADV/90/202/2016）。