整合离子组学与靶向代谢组学揭示硬粒小麦（Triticum durum Desf.）基因型干旱响应的关键标记物及其在抗逆育种中的应用价值

本研究针对地中海地区硬粒小麦受干旱胁迫严重影响的问题，通过整合离子组学和靶向代谢组学技术，系统评估了六种不同基因型硬粒小麦在干旱条件下的形态生理、生化和分子响应。研究发现14个干旱效应标记和16个基因型变异标记，成功将基因型按耐旱性分类，揭示了离子稳态、基因调控（如TdDHN15.3）和脂质调整等独特耐旱策略，为抗旱基因型选育和粮食安全提升提供了关键理论基础与标记资源。

　　

随着气候变化导致的干旱频率和强度不断增加，地中海地区的作物种植受到严重影响，其中硬粒小麦（Triticum durum Desf.）作为全球主要粮食作物之一，尤其易受干旱条件的影响。水分短缺直接降低了硬粒小麦的分蘖能力和谷物产量，进而影响农民收入，形成经济约束循环，并引发更广泛的经济效应，如农民消费能力下降、农业社区失业率上升以及地方政府税收减少，最终影响公共服务的提供。因此，迫切需要采取综合措施提高作物产量，而深入了解不同硬粒小麦基因型对干旱响应的基本机制，对于选育和培育具有增强耐旱性的品种至关重要。

当前生态生理学研究表明，硬粒小麦采用一系列复杂的适应机制来应对干旱条件，主要包括水分管理和胁迫耐受策略。例如，为缓解水资源短缺，硬粒小麦可通过减少叶面积来限制蒸腾，发展更深的根系以获取更深的水源，并调节气孔关闭以节约用水。在胁迫恢复力方面，硬粒小麦可产生保护性化合物以清除有害自由基，调整激素水平以触发胁迫响应，并积累相容性溶质以在干旱期间维持细胞功能。营养动态与胁迫适应之间的相互作用对硬粒小麦至关重要，植物在干旱条件下调整营养水平的能力（即矿物质营养可塑性）是区分耐旱基因型的关键因素。此外，代谢组学提供了植物在干旱胁迫下生化状态的全面概述，突出了增强胁迫恢复力的关键初级和次级代谢物，这些代谢物与渗透保护、抗氧化能力和激素调节相关。其中，植物激素是影响植物生长和胁迫响应的关键信号，包括营养稳态，尤其是在干旱期间。膜脂以及木栓质和角质蜡对于抵御环境胁迫的结构保护和维持跨膜离子通量至关重要，植物通过调整膜脂组成，特别是饱和脂肪酸（SFAs）和多不饱和脂肪酸（PUFAs）的平衡，来优化膜流动性，这对于有效的营养运输至关重要。胁迫诱导的活性氧（ROS）生成可能破坏脂质组谱，对膜流动性和稳定性产生负面影响，而增加的PUFA水平可以增强膜流动性，支持细胞功能，并在干旱条件下促进更好的水分保持和营养稳态。最后，次级代谢物作为信号分子影响生理过程，包括营养吸收和同化，例如类黄酮可以与营养信号通路相互作用，调节植物对营养可利用性的响应。

在此背景下，本研究旨在通过探索矿物质营养可塑性及其与形态、生理和生化参数的关系，剖析硬粒小麦的多方面干旱响应特征。基于先前在幼苗期对耐旱性的评估，研究人员选择了六种不同的硬粒小麦基因型：BULEL、SVEVO、SVEMS16、SVEMS1、ETRUSCO和S.CAP。为了收集形态生理和生化数据，植物在根箱系统中生长40天，并在受控干旱条件下进行培养。该系统允许精确调节水分可利用性，并有助于评估叶和根介导的干旱响应。值得注意的是，除研究根系结构外，根箱系统还允许收集土壤挥发组数据，为了解不同硬粒小麦基因型如何改变地下挥发性有机化合物（VOCs）提供了见解。因此，土壤挥发性谱与形态生理、生化和矿物质营养参数一起分析，以实现对干旱响应机制背后机制的全面理解。根释放的挥发性和可溶性化合物在塑造根相关微生物组方面发挥关键作用，这是介导植物胁迫响应的关键组成部分，随后影响营养吸收和胁迫信号通路。虽然先前的研究已经证明了这些基因型根系分泌组谱的干旱依赖性变异，但本研究旨在进一步阐明干旱条件下土壤挥发组的变化。

为实现这些目标，研究人员结合了靶向代谢组分析和离子组分析，以剖析六种表现出对比耐旱水平的硬粒小麦基因型的干旱响应。通过整合这些互补数据集，研究旨在（i）识别胁迫响应和基因型特异的生化标记，（ii）阐明水分赤字下营养稳态与代谢调节之间的相互作用，以及（iii）根据其适应策略对基因型进行分类。据所知，这是首次在硬粒小麦中采用如此整合方法的研究，为针对水分有限环境恢复力的育种计划提供了直接意义的新见解。该研究论文发表在《Plant Stress》上。

为开展本研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：使用根箱生长系统在受控条件下培养六种硬粒小麦基因型，并设置对照（100%田间持水量）和干旱胁迫（40%田间持水量）两种处理；通过图像分析软件（SmartRoot和ImageJ）测定根系形态参数（根数、根长和根角度）；利用HPLC-DAD分析光合色素（叶绿素和类胡萝卜素）及其降解产物；采用同位素比率质谱（IRMS）测定碳同位素判别（δ¹³C）以评估水分利用效率；通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）和毛细管电泳（CE）进行离子组分析，定量宏量和微量元素以及无机阴离子；利用气相色谱-质谱（GC-MS）和气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）分析土壤挥发性有机化合物（VOCs）和脂肪酸甲酯（FAMEs）；采用HPLC-MS/MS进行靶向代谢组学分析，包括植物激素（如IAA、ABA、JA、SA等）和多酚类化合物（如黄酮醇、黄烷酮、黄烷酮醇和甲基黄酮醇）的定量；通过实时定量PCR（qRT-PCR）检测干旱响应基因（如TdDHN15.3、TdP5CS、TdWRKY2、TdDRF1和TdSHN1）的表达水平；最后使用多变量统计方法（如PLS-DA）对数据进行整合分析，以识别关键判别标记和基因型分类。

3.1. 硬粒小麦基因型表现出对干旱胁迫的形态、分子和植物激素调整

干旱胁迫对所有基因型的生长均产生显著且差异性的影响。在形态水平上，干旱影响了所有基因型的地上部鲜重（SFW），其中SVEMS16、BULEL和SVEVO的减少最少。在干旱条件下，除SVEMS16外，所有基因型的叶面积（LA）均显著减少；BULEL和SVEVO显示轻微减少，而S.CAP和ETRUSCO减少最大。干旱还增加了SVEMS16和BULEL的根生长角度（RA）。SVEMS16和SVEMS1显示更长的根长（RL），但根数（RN）更少。δ¹³C值的变化表明水分利用效率（WUE）存在差异，SVEMS16显示最大变异，而SVEMS1和ETRUSCO变异最小。干旱耐受相关基因（如TdDHN15.3、TdP5CS、TdWRKY2、TdDRF1和TdSHN1）的表达分析也揭示了显著变异。TdDHN15.3在除ETRUSCO外的所有基因型中均上调，其中BULEL、SVEMS1和SVEVO的增加最大。相反，TdP5CS在大多数基因型中减少，在SVEMS16中减少最强烈，仅在SVEMS1中增加。TdWRKY2表达模式分歧，在SVEMS1、ETRUSCO和S.CAP中上调，在SVEVO、BULEL和SVEMS16中下调。此外，TdDRF1在SVEMS16、SVEVO、ETRUSCO和S.CAP中增加，而TdSHN1在SVEMS16、SVEMS1和ETRUSCO中上升，但在BULEL和SVEVO中减少。

干旱相关植物激素的HPLC分析显示了基因型特异的响应。SVEMS1表现出升高的IAA和tZ，而其他激素稳定。BULEL增加了IAA、OPDA和SA。相反，SVEVO显示更高的JA，而其他激素未变。相比之下，SVEMS16和S.CAP减少了IAA和OPDA。值得注意的是，SVEMS16显示tZ增加，而S.CAP显示mSA水平升高。有趣的是，ETRUSCO产生更多的SA和JA，但更少的tZ、ABA和mSA。

3.2. 干旱条件下硬粒小麦的地上部离子组可塑性

干旱显著且差异性地影响了硬粒小麦的地上部离子组谱，影响了跨基因型的宏量和微量营养水平。关于宏量营养，磷酸盐（PO₄^3-）在SVEMS1和SVEVO中增加，但在ETRUSCO中减少。钾（K）水平显示基因型依赖性响应，在SVEMS1、BULEL和SVEMS16中增加，而在ETRUSCO和S.CAP中减少。硝酸盐（NO₃^-）在BULEL和SVEMS1中上升，但在SVEMS16中下降。对于微量营养，总钠（Na）水平在SVEMS16、SVEVO和ETRUSCO中增加。氯化物（Cl^-）在SVEMS1和SVEVO中上升，而在ETRUSCO中下降。锰（Mn）在除BULEL外的所有基因型中增加。有趣的是，砷（As）在干旱下所有基因型中增加，在ETRUSCO和S.CAP中观察到最高值。相反，钼（Mo）在所有基因型中减少，特别是在ETRUSCO和S.CAP中。最后，镍（Ni）在SVEMS1和SVEVO中增加，但在ETRUSCO中下降。

3.3. 干旱胁迫对脂肪酸谱的影响

GC-MS和GC-FID分析在硬粒小麦叶片中鉴定出六种脂肪酸：两种饱和脂肪酸（SFAs）、两种单不饱和脂肪酸（MUFAs）和两种多不饱和脂肪酸（PUFAs）。基因型响应分化为三种不同的代谢模式。SVEVO、BULEL和S.CAP表现出升高的SFAs和MUFAs。其中，SVEVO和BULEL维持或增强PUFA水平，而S.CAP减少它们。此外，SVEMS1展示了卓越的脂质稳态，具有稳定的SFA、MUFA和PUFA值。相比之下，SVEMS16和ETRUSCO具有MUFA耗竭，且SFA/PUFA谱未改变。ETRUSCO具有最大的硬脂酸下降，而SVEMS16具有最大的油酸损失。

3.4. 光合色素谱揭示硬粒小麦基因型对干旱的对比响应

HPLC分析通过评估光合色素及其降解产物的变化，揭示了硬粒小麦叶片中干旱诱导的光合色素变化。未检测到晚期降解产物，而叶绿素含量在基因型间显示显著变异。SVEMS16具有最高的总叶绿素含量增加，其次是BULEL、SVEMS1和SVEVO。相比之下，ETRUSCO和S.CAP显示叶绿素含量减少。SVEMS16、BULEL和SVEVO增加Chl a和Chl b，而ETRUSCO和S.CAP尽管总叶绿素含量较低，但保留更高的Chl b。关于早期降解产物，SVEMS1增加叶绿素a'和叶绿素b'。相反，ETRUSCO和S.CAP减少叶绿素a'但增加叶绿素b'，而SVEMS16减少a'和b'。中期降解产物将基因分组：BULEL和S.CAP增加中期降解产物但减少脱镁叶绿素b，而SVEMS1增加中期降解产物，SVEVO显示减少。

HPLC-DAD在干旱条件下鉴定出硬粒小麦基因型中的11种类胡萝卜素，揭示了三种响应模式。第一组包括BULEL和ETRUSCO，显示总类胡萝卜素含量主要减少。然而，BULEL轻微增加9-顺式-β-胡萝卜素并保持反式-新黄质/反式-新黄质稳定。第二组包括SVEVO和SVEMS1，广泛积累类胡萝卜素，其中叶黄素、反式-紫黄质、全反式-β-胡萝卜素和9'-顺式-α-胡萝卜素显著增加。最后，第三组SVEMS16和S.CAP显示更具选择性的响应。SVEMS16减少叶黄素和未知类胡萝卜素#3，其他色素保持不变。S.CAP基因型增加反式-新黄质，但其他方面保持稳定，总类胡萝卜素含量无显著变化。

3.5. 干旱驱动的次级代谢物谱可塑性区分硬粒小麦基因型的响应

HPLC-MS/MS在硬粒小麦中鉴定出20种不同的次级代谢物，包括8种黄酮醇、2种黄烷酮、8种黄烷酮醇和2种甲基黄酮醇，揭示了基因型特异的干旱响应。总多酚在ETRUSCO和S.CAP中轻微上升，在SVEMS16中强烈上升，而在SVEMS1和SVEVO中保持稳定。BULEL是唯一经历减少的基因型。SVEMS16增加所有类黄酮类别，特别是甲基黄酮醇（如 narcissoside）。S.CAP具有更高的黄酮醇（如槲皮素）和黄烷酮（如 narirutin），稳定的甲基黄酮醇，但减少黄烷酮醇（如 taxifolin、ampelopsin）。SVEVO和ETRUSCO减少黄酮醇（如山奈酚和槲皮素）和甲基黄酮醇（特别是 narcissoside），同时增加黄烷酮醇（如 aromadendrin 和 taxifolin）。BULEL减少黄酮醇（如山奈酚和黄芪苷）和黄烷酮（特别是 narirutin），同时增加甲基黄酮醇（如 isorhamnetin）。最后，SVEMS1减少黄烷酮醇（如 ampelopsin）和甲基黄酮醇（特别是 isorhamnetin），但显著增加黄烷酮（特别是 narirutin）。

3.6. 多变量解析分析揭示硬粒小麦耐旱机制的关键判别性状

在标准化各种参数后，研究人员进行了全面分析以识别硬粒小麦适应胁迫的关键标记。首先将植物按条件（对照与胁迫条件）分组，而不考虑基因型，并通过PLS-DA进行分析，该分析区分了条件，解释了成分1中9.7%的方差和成分2中21.1%的方差。关键判别参数包括2个形态性状（SFW和LA）、3种离子（Na⁺、Mo和As）、4种光合色素及相关降解产物（叶绿素b、脱镁叶绿素a、脱镁叶绿素a'和脱镁叶绿素b'）、6种类胡萝卜素（叶黄素、反式-新黄质和15-顺式-β-胡萝卜素、未知类胡萝卜素#1、未知类胡萝卜素#2、未知类胡萝卜素#3）、1种激素（tZ）、2个基因（TdP5CS和TdDHN15.3）和8种类黄酮（山奈酚、山奈酚3-葡萄糖醛酸苷、Ampelopsin 3-葡萄糖苷、黄芪苷、Nicotiflorin、槲皮素、Isohamnetin和芦丁）。将基因型引入第二个PLS-DA，解释了成分1中33.4%的方差和成分2中12.7%的方差，显示基因型影响干旱响应。关键判别变量包括2个形态性状（LA和RL）、6种矿物质（K⁺、K、Na、As、Ni和Mn）、4种光合色素和降解产物（叶绿素b、叶绿素b'、叶绿素a'、脱镁叶绿素a'）、2种类胡萝卜素（未知类胡萝卜素#2、反式-新黄质）、1种脂肪酸（硬脂酸）、1种激素（OPDA）、1个基因（TdDHN15.3）和几种类黄酮（槲皮素、杨梅素、Taxifolin 3-阿拉伯糖苷、Ampelopsin-阿拉伯糖苷、Narcissoside、Isohamnetin、芦丁、黄芪苷、Taxifollin、山奈酚3-葡萄糖醛酸苷和槲皮苷）。最后，结合基因型和生长条件的PLS-DA揭示了两个见解：基因型聚分为三个不同的响应类别：（i）BULEL、SVEVO和SVEMS16在对照和胁迫条件之间无显著差异；（ii）ETRUSCO和S.CAP在对照和胁迫条件之间分歧；（iii）SVEMS1通过补偿机制类似于耐旱基因型。其次，系统发育关系反映在干旱响应中：较老品种（S.CAP和ETRUSCO）聚在一起，具有正的成分2和负的成分1值，而较近期开发的（SVEMS16和SVEMS1）且与SVEVO系统发育相关的，聚为正的成分1值。最后，BULEL独特定位在第三象限，两个成分均为负值，可能由于其六倍体遗传背景。

3.7. 根箱系统允许土壤挥发组捕获并揭示基因型驱动的干旱下挥发性有机化合物调节

GC-MS/MS鉴定出110种不同的挥发性化合物，揭示了对照和胁迫条件之间以及基因型之间的显著变异。无监督多变量分析可视化了这些集体代谢物变化，有效地基于代谢谱对样品分组，成分1 T分数清楚区分对照和胁迫条件。监督PLS-DA进一步突出了与生长条件和基因型相关的代谢变异，揭示了三个不同的簇：（i）BULEL，特征为成分1和成分2均为负值；（ii）ETRUSCO和S.CAP，显示负成分1和正成分2值；（iii）SVEVO、SVEMS16和SVEMS1，主要通过正成分1值区分，成分2进一步将SVEVO和SVEMS16与SVEMS1分离。

4. 讨论与结论

本研究揭示了硬粒小麦基因型对干旱胁迫的复杂适应机制，通过整合离子组学、代谢组学、生理生化及分子生物学数据，成功识别了与耐旱性相关的关键标记物。研究发现，不同基因型采用独特的策略应对干旱，包括形态调整（如叶面积维持、根系构型优化）、生理适应（如水分利用效率提升、光合色素稳定性）、离子稳态（如Na⁺、K⁺积累）、代谢重编程（如脂肪酸组成调整、类黄酮积累）以及基因表达调控（如TdDHN15.3上调）。这些响应不仅具有基因型特异性，而且反映了其遗传背景和系统发育关系。

耐旱基因型（如SVEMS16、SVEVO和BULEL）通过维持较高的生物量、稳定的光合能力、有效的离子平衡和增强的抗氧化防御表现出更好的适应性。其中，SVEMS16通过“陡长”根系增强水分获取，同时保持叶面积和叶绿素含量，并上调脱水素基因表达，显示出综合的耐旱机制。SVEVO和BULEL则分别通过增加多不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸调整膜流动性，以及积累渗透调节物质（如Na⁺）来应对胁迫。敏感基因型（如S.CAP和ETRUSCO）则表现出光合能力下降、离子稳态失调、抗氧化能力减弱以及砷积累增加，表明其适应机制不足。值得注意的是，SVEMS1通过补偿机制（如营养吸收调整、类胡萝卜素积累）表现出中等耐旱性，而ETRUSCO在营养生长阶段显示出更高的敏感性。

此外，土壤挥发组分析揭示了基因型特异的挥发性有机化合物谱，反映了地上部性状模式，并表明微生物招募在干旱响应中可能发挥作用。这为进一步研究根际互作及其在胁迫适应中的作用提供了方向。

总体而言，本研究不仅提供了硬粒小麦干旱适应的全面视角，而且为育种计划提供了实用的标记物和策略。通过识别关键性状和机制，研究人员可以更有效地选育和开发适应水资源有限环境的耐旱基因型，从而提升小麦生产的可持续性和粮食安全。未来的研究可以进一步探索这些标记物在田间条件下的适用性，并验证其在大规模育种中的应用潜力。