酶响应性脂质体靶向内质网应激介导的细胞凋亡治疗类风湿关节炎

本研究针对类风湿关节炎(RA)中成纤维样滑膜细胞(FLSs)凋亡不足的核心病理机制，创新性地开发了酶响应型靶向脂质体(CLT-FELipos)，该递送系统通过FAP-α酶触发PEG脱落暴露HA靶向CD44受体，并利用KDEL肽精准导向内质网(ER)，成功实现雷公藤红素(CLT)在FLSs内质网的特异性富集。实验证实CLT-FELipos可有效诱导内质网应激(ERS)介导的细胞凋亡，显著改善 adjuvant诱导关节炎(AIA)大鼠的关节肿胀和骨侵蚀，为RA治疗提供了新型靶向治疗策略。

　　

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种困扰全球0.5-1%人口的慢性自身免疫性疾病，其特征是持续的滑膜炎症和关节破坏。当前临床治疗主要依赖各类改善病情的抗风湿药物（DMARDs），但传统合成DMARDs如甲氨蝶呤易引发骨髓抑制和肝损伤，生物DMARDs虽能拮抗炎症因子但存在副作用多、成本高的局限，而新型靶向合成DMARDs如托法替尼则可能诱发严重感染和恶性肿瘤。更严峻的是，相当比例患者对这些药物反应不佳。随着纳米医学发展，虽出现了一系列具有炎症靶向能力的纳米药物递送系统，在减轻症状和降低副作用方面展现出优势，但这些仍属于对症治疗，疗效难以持久。因此，通过深入理解RA病理生理机制，开发针对疾病根本病理的安全有效干预策略迫在眉睫。

滑膜是衬覆于关节囊内层的疏松结缔组织，其中的成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-Like Synoviocytes, FLSs）是RA发病机制中的核心效应细胞。这些细胞具有粘附和侵袭特性，能持续分泌炎症细胞因子、小分子介质和降解细胞外基质及软骨的蛋白酶，进而迁移至健康关节引发疾病。在健康滑膜中，调控FLSs正常凋亡和衰老的机制维持着滑膜微环境的免疫稳态。然而研究发现，FLSs凋亡减少和异常增殖是RA发生发展以及滑膜炎症和骨破坏的关键伴随事件。这表明，恢复FLSs增殖与凋亡之间的平衡可能从根本上有助于RA的治疗。

内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）是动物细胞中最大的细胞内膜结合细胞器，主要负责蛋白质的生物合成、折叠和翻译后修饰。当内质网功能障碍导致其腔内积累新合成的错误折叠蛋白时，就会发生内质网应激（ER Stress, ERS），触发内质网相关蛋白降解和未折叠蛋白反应等多种信号响应。适度的ERS有助于正确蛋白质折叠和细胞存活，但持续的ERS会激活细胞死亡信号，导致凋亡。基于此，通过ERS诱导细胞凋亡的策略有望成为治疗RA的可行方法。

雷公藤红素（Celastrol, CLT）是从雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook f.）根和茎中提取的五环三萜类化合物，是中成药雷公藤多苷片的活性成分之一。CLT具有广泛的药理活性，在抗炎、抗癌和抗感染方面均显示出疗效。研究表明，CLT可通过破坏ER功能诱导ERS和凋亡，从而对抗疾病。然而，游离CLT存在水溶性差、毒性高和生物利用度低等诸多固有缺陷，严重阻碍其疗效。纳米递送技术为这些问题提供了潜在解决方案。此外，当通过RA炎症部位增生的血管时，纳米药物可通过“通过渗漏血管外渗和随后炎症细胞介导的滞留”（ELVIS）效应在炎症部位定位，实现向关节的靶向递送。基于这些考虑，我们假设利用纳米技术将CLT靶向递送至FLSs的ER可能破坏ER功能并诱导ERS，从而精确改善FLSs凋亡不足，实现RA的有效治疗。

本研究由Chenglong Li、Can Qian、Jie Zhang、Ya Huang、Xiaolin Zhao、Huaiyu Su、Yingying Hou和Chen Li合作完成，论文发表在《Phytomedicine》上。研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过化学合成制备了功能辅料DSPE-mPEG2K-KDEL和Chol-HA-GPA-mPEG2K，并通过薄膜水化结合高压均质法制备了CLT-FELipos；利用动态光散射、透射电镜和高效液相色谱对纳米粒的粒径、形态和包封率进行了表征；通过体外细胞实验（采用RA来源的永生化FLSs）评估了细胞摄取、亚细胞定位（使用多种细胞器特异性探针和共聚焦显微镜）和凋亡诱导能力（流式细胞术、Western Blot）；建立了佐剂诱导关节炎（AIA）大鼠模型，通过活体成像系统评估体内分布，并通过多种技术（组织学分析、免疫组化、微CT、ELISA）综合评价治疗效果和生物相容性。

Synthesis and characterization of CLT-FELipos

成功合成了DSPE-mPEG2K-KDEL和Chol-HA-GPA-mPEG2K，并通过¹H-NMR验证。制备的CLT-FELipos和CLT-Lipos粒径分布窄（分别为136.1 ± 8.0 nm和128.4 ± 7.1 nm），电位分别为-8.64 ± 0.68 mV和-3.78 ± 0.52 mV，电镜显示形态均匀球形，包封率均高达96%左右，且在生理盐水和血清中稳定性良好。

Cellular uptake, Subcellular Localization and Distribution of FELipos

载药Coumarin-6的C6-FELipos在FLSs中的摄取显著高于C6-Lipos或C6溶液，且该摄取可被FAP-α抗体抑制，证实了其FAP-α响应靶向机制。共聚焦显微镜观察表明，C6-FELipos与内质网（ER）清晰共定位，而与溶酶体、线粒体和高尔基体共定位极少。时间过程分析显示仅有少量颗粒在2h和5h时定位于溶酶体，表明FELipos具有部分溶酶体逃逸能力。这些发现表明FELipos能有效靶向FLSs并特异性定位于其ER。

CLT-FELipos increase ERS-mediated apoptosis of FLSs in vitro

流式细胞术分析显示，CLT-FELipos处理能显著增加活化FLSs的凋亡细胞百分比，效果优于CLT-Lipos和CLT溶液，且该效应可被FAP-α抗体减弱。高分辨率TEM分析揭示，CLT-FELipos处理的FLSs出现显著的ER腔扩张、膜结构肿胀和空泡形成，这些都是ERS诱导的标志。同时，细胞体积减小、核固缩、染色质边缘化和聚集等凋亡形态学变化也清晰可见。免疫荧光显示，CLT-FELipos处理导致ER结构出现点状染色，表明其结构被显著破坏。Western Blot分析表明，CLT-FELipos与ERS诱导剂毒胡萝卜素（TG）类似，能诱导ERS标志蛋白（如PDI、IRE1α、ATF4）的表达，并显著上调ERS介导的凋亡信号CHOP和cleaved caspase-3，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2。这些结果共同支持CLT-FELipos作为ERS诱导剂，触发不受控制的ERS，最终导致FLSs凋亡。

FELipos target ER of FLSs within inflamed joints

活体成像显示，载DiD的DiD-FELipos在炎症关节中的积累显著高于DiD-Lipos和DiD溶液，且在肺、肝、脾中的非特异性积累减少。流式细胞术分析关节来源的FLSs显示，CLT-FELipos处理组中Vimentin⁺DiD⁺Calnexin⁺（ER标志）细胞的比例显著高于其他组，表明FELipos能促进药物靶向递送至炎症关节内FLSs的ER。

CLT-FELipos decrease the number of FLSs in arthritic joints

在AIA大鼠治疗实验中，CLT-FELipos治疗组关节的TUNEL染色显示最高的细胞凋亡水平，且凋亡细胞主要为FLSs（Vimentin⁺）。免疫荧光显示CLT-FELipos显著减少了滑膜中FLSs的数量。免疫组化进一步表明，CLT-FELipos治疗显著提升了ERS诱导凋亡的标志物CHOP和cleaved caspase-3的表达。此外，CLT-FELipos治疗降低了促骨吸收因子RANKL的表达，增加了其 decoy受体OPG的表达，从而降低了RANKL/OPG比率，表明恢复了骨功能平衡。ELISA检测显示CLT-FELipos治疗组血清中促炎细胞因子TNF-α水平最低。这些效应与关节中FLSs数量的减少正相关。

CLT-FELipos alleviate joint inflammation and bone erosion in rats

在AIA大鼠模型中，CLT-FELipos在减轻踝关节和爪肿胀方面表现出优于CLT-Lipos的疗效，爪厚度接近健康对照组。组织学分析显示，CLT-FELipos治疗恢复了关节腔结构至接近正常状态，仅有 minimal 炎症浸润和软骨侵蚀，番红O和甲苯胺蓝阳性染色面积显著大于其他组。微CT重建显示，CLT-FELipos治疗组骨表面更光滑，类似于正常组，表明其具有逆转骨侵蚀的强大能力。对骨微结构参数（BMD、BS/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp）的全面分析证实了CLT-FELipos对骨侵蚀的保护和修复作用。

In vivo biocompatibility evaluation

治疗期间所有组大鼠体重持续增加。主要器官（心、肝、肾）的组织学分析未显示明显的炎症浸润或细胞坏死迹象。血清肝功能（ALT、AST）和肾功能（BUN、Cr）指标在各组间无显著差异，表明治疗未产生肝毒性或肾毒性，具有良好的生物相容性。

讨论与结论（Discussion and Conclusions）

本研究开发了一种酶响应性药物递送系统（CLT-FELipos），用于特异性靶向FLSs的内质网以递送CLT。结果证明了调节FLSs凋亡和增殖平衡作为RA治疗策略的潜力。该递送系统确保CLT精确定位于FLSs的ER内，通过诱导ERS有效诱导FLSs凋亡。在机制上，CLT-FELipos通过调节凋亡相关蛋白（包括CHOP和cleaved caspase-3）的表达触发ERS介导的凋亡。这种亚细胞靶向药物递送系统显著减少了关节炎关节中FLSs的数量，从而减轻了滑膜炎症并缓解了骨损伤。该策略不同于现有临床药物仅拮抗炎症介质或细胞的对症治疗，而是通过在细胞病理水平上诱导致病性FLSs的凋亡，为RA提供了病因性治疗。此外，将酶响应技术（FAP-α响应暴露HA靶向CD44）与ER靶向肽（KDEL）、PEG修饰和脂质体制备技术相结合，赋予了制剂将CLT主动递送至炎症关节FLSs ER的能力，这种创新的材料设计此前未见报道。作为一种成熟的临床药物剂型，本研究中的脂质体在RA有效治疗剂量下未表现出明显不良反应，具有巨大的临床转化潜力。 collectively, these results support its promise as a viable therapeutic approach for clinical translation.