贝莱斯芽孢杆菌YTQ3脂肽通过破坏细胞壁与膜结构并诱导线粒体功能障碍抑制灰葡萄孢菌的机制研究

本研究针对灰霉病(Botrytis cinerea)引起的采后重大经济损失问题，探讨了贝莱斯芽孢杆菌YTQ3来源的脂肽(YTQ3-LPs)的抗真菌机制。研究发现YTQ3-LPs通过破坏细胞壁(β-1,3-glucan和chitin减少)和细胞膜(ergosterol降低、电解质泄漏)，诱导线粒体功能障碍(MMP下降、ATP耗尽)和氧化应激(ROS积累、SOD/CAT抑制)，并下调毒力基因表达，最终在体外和葡萄果实模型中有效抑制灰霉病，为采后病害绿色防控提供了新型生物防治策略。

　　

灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的一种毁灭性植物病害，作为典型的死体营养型病原真菌，其宿主范围极广，可侵染1400多种植物，包括葡萄、茄科作物和软质水果等重要经济作物，被列为全球第二大植物病原真菌。除了造成田间病害外，该病原体在采后阶段仍具有高度破坏性，导致果实软化和腐烂，直至完全丧失商品价值。据估计，灰霉病在全球范围内每年造成20-50%的产量损失，而采后感染进一步加剧了经济影响，全球每年损失高达100-1000亿美元。数十年来，化学杀菌剂一直是管理灰霉病感染的主要策略，然而耐药菌株的出现，加上对化学品过度使用带来的健康风险和环境污染的日益担忧，迫切需要开发可持续、安全且环保的方法来防治灰霉病。

在此背景下，利用有益微生物或微生物源生物农药作为环境友好型的植物病害防控和农业增产替代方案正在兴起。芽孢杆菌(Bacillus)属是细菌拮抗剂应用的主力军，因其独特的快速繁殖能力、抗逆性和广泛的生物防治能力而备受青睐。该属成员还能促进植物生长、定殖根系并诱导植物系统抗性机制。更重要的是，它们能产生具有潜在抗菌和抗真菌特性的广谱抗菌活性物质，其中与芽孢杆菌成员抗真菌活性相关的主要因素之一是脂肽类物质的产生。

脂肽由非核糖体肽合成酶合成，是低分子量寡肽。其两亲性特性使其能够与亲水和疏水环境相互作用，从而在多种生物过程中发挥效能。芽孢杆菌主要产生三类脂肽：iturin、surfactin和fengycin。这些物质具有相似的结构，都具有一个连接到短环肽上的脂质尾巴。脂肽表现出多样的异构体，在肽环化模式、氨基酸组成和脂肪酸链特性（包括长度和分支）方面存在差异，这些结构差异被认为是其在体内外研究中观察到对抗真菌病原体不同效果的基础。

在此前的研究中，研究团队发现贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YTQ3的无细胞上清液(CFS)在7.5%(v:v)浓度下可完全抑制(100%)灰葡萄孢菌的菌丝生长。全基因组测序和质谱分析表明，脂肽，特别是surfactin和fengycin，是负责这种抑制的主要生物活性化合物。鉴于该菌株强烈的抗真菌效果，阐明其作用机制有助于开发新型生物防治策略。

发表在《Postharvest Biology and Technology》的这项研究首先评估了YTQ3-LPs对灰葡萄孢菌的体外抗真菌功效，然后阐明了其潜在的抗真菌机制，最终通过评估其对采后葡萄果实灰霉病发展的抑制效果验证了其实际应用潜力。研究人员通过体外抑菌实验、扫描电子显微镜(SEM)观察、荧光定位技术、细胞壁和细胞膜完整性分析、氧化应激指标检测、线粒体功能评估以及毒力基因表达分析等多种技术手段，系统深入地探究了YTQ3-LPs的作用机制。研究使用的灰葡萄孢菌菌株B05.10由中国科学院植物研究所田世平教授实验室惠赠，所有实验均设置三次重复。

3.1. YTQ3-LPs对灰葡萄孢菌的体外抑制作用

研究发现YTQ3-LPs剂量依赖性地抑制真菌生长，在培养第5天，2mg mL^-1 YTQ3-LPs对灰葡萄孢菌的抑制率仍可达82.5%。YTQ3-LPs还显著抑制灰葡萄孢菌孢子萌发和芽管生长，0.75mg mL^-1浓度可完全抑制孢子萌发。

3.2. YTQ3-LPs对灰葡萄孢菌形态的影响

扫描电镜观察显示，YTQ3-LPs处理引起菌丝和孢子的严重形态损伤，包括菌丝收缩、孔洞形成、结构变形和广泛塌陷，这些损伤程度与浓度呈正相关。

3.3. YTQ3-LPs诱导灰葡萄孢菌细胞壁损伤

钙荧光白染色显示YTQ3-LPs处理后荧光强度显著减弱，表明几丁质分布紊乱。碱性磷酸酶(AKP)泄漏增加，几丁质和β-1,3-葡聚糖含量显著降低，证明YTQ3-LPs破坏了细胞壁结构完整性。

3.4. YTQ3-LPs诱导质膜损伤

碘化丙啶(PI)染色显示YTQ3-LPs剂量依赖性地破坏细胞膜完整性。麦角固醇含量显著降低，核酸和蛋白质泄漏增加，电导率升高，表明YTQ3-LPs通过破坏膜结构导致细胞内容物泄漏。

3.5. YTQ3-LPs在灰葡萄孢菌中的细胞内定位

荧光定位实验证实FITC标记的YTQ3-LPs能够穿透细胞壁和细胞膜并在细胞内积累，主要定位于细胞核区域，表明其作用靶点不限于细胞表面。

3.6. YTQ3-LPs增加灰葡萄孢菌ROS产生

DCFH-DA染色显示YTQ3-LPs处理导致活性氧(ROS)积累，H₂O₂浓度显著升高。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性被抑制，丙二醛(MDA)含量增加，表明YTQ3-LPs引起氧化应激和脂质过氧化。

3.7. YTQ3-LPs诱导灰葡萄孢菌线粒体功能障碍

JC-1染色显示线粒体膜电位(MMP)降低。ATP含量和ATP酶活性显著下降，琥珀酸脱氢酶(SDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)活性被抑制，表明YTQ3-LPs引起线粒体功能紊乱和能量代谢障碍。

3.8. YTQ3-LPs对灰葡萄孢菌致病性相关基因表达的影响

qPCR分析显示YTQ3-LPs下调了六个与毒力和生长相关基因的表达，包括细胞壁降解酶基因(BcXyn11A、BcPG1、BcPME1)、磷脂酶基因(BcPLC1)和MAP激酶基因(BcBMP1、BcBMP3)。

3.9. YTQ3-LPs对灰葡萄孢菌的体内抗真菌活性

体内实验表明，YTQ3-LPs(7.5mg mL^-1)完全抑制了葡萄果实灰霉病的发展，病斑直径减少83.9%，发病率降低53.3%，显示出良好的实际应用前景。

研究结论表明，YTQ3-LPs通过多机制协同作用抑制灰葡萄孢菌：首先破坏细胞壁和细胞膜结构完整性，然后穿透细胞并在细胞内积累，诱导线粒体功能障碍和氧化应激，同时下调毒力相关基因表达。这种多靶点作用机制使YTQ3-LPs成为一种高效的抗真菌剂，对采后灰霉病防治具有重要应用价值。

讨论部分强调，与化学杀菌剂相比，YTQ3-LPs具有环境友好、不易产生耐药性等优势。研究发现YTQ3-LPs在pH、温度、紫外线照射以及各种金属、有机溶剂和表面活性剂存在下均表现出良好的稳定性，这为其在实际应用中的适应性提供了有力支持。虽然大规模生产成本目前仍高于传统杀菌剂如prochloraz，但其良好的环境特性和较低的耐药性发展潜力在有机或残留敏感市场中具有附加价值。

该研究不仅阐明了YTQ3-LPs的抗真菌机制，还为开发新型生物防治剂提供了理论基础和实践依据。未来的研究需要进一步优化制剂配方，开展田间试验验证在不同环境条件下的效果，并评估其与其他抗真菌剂的协同作用，以推动其在实际农业生产中的应用。