多中心比较LC-MS/MS、放射免疫测定法和ELISA在检测唾液皮质醇和睾酮方面的应用

《Psychoneuroendocrinology》：Multicenter comparison of LC-MS/MS, radioimmunoassay, and ELISA for assessment of salivary cortisol and testosterone

激素检测方法学比较研究，评估LC-MS/MS、RIA和ELISA在唾液皮质醇和睾酮检测中的有效性、可靠性和实验室间一致性，发现低浓度下方法差异显著，需根据检测需求选择合适方法。

　　在社会神经内分泌学领域，激素的测量是一种广泛应用的工具，用于研究激素对生理和行为的影响。唾液激素检测因其非侵入性、简便性等优点，已成为许多实验室的首选方法。与血液样本相比，唾液样本的采集更为容易，但唾液的复杂组成和激素浓度较低的特点，使得其检测面临较大的挑战。因此，准确和可靠的唾液激素检测方法至关重要。

目前，激素检测主要依赖于几种分析技术。其中，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）因其高灵敏度和特异性，即使在低浓度情况下也能提供可靠的检测结果，被认为是金标准方法。然而，LC-MS/MS的实施成本较高，且需要专业的技术和分析能力。因此，许多社会神经内分泌学实验室更倾向于使用酶联免疫吸附测定（ELISA）和放射免疫测定（RIA）等技术。这些方法在成本和操作难度上更具优势，但临床内分泌学家对使用免疫测定（IAs）的潜在有效性表示担忧。这种担忧甚至导致《临床内分泌学与代谢杂志》一度拒绝所有基于免疫测定方法提交的论文。

此前的研究表明，免疫测定方法容易受到与目标激素结构相似的其他化合物的干扰，例如类固醇或其他唾液成分如蛋白质。这些干扰物可能与检测抗体发生反应，从而导致激素水平的高估。在ELISA检测中，这种缺乏特异性的问题尤为明显，一些商用ELISA试剂盒未能检测到男性与女性之间睾酮（T）的自然比例约为10，而是给出了较低的比值，如2到5。尽管在男性样本中，LC-MS/MS与ELISA或RIA之间的相关性较强，但在女性或儿童样本中，这种相关性则不理想。

此外，方法的可比性还受到方法稳健性的影响。Prasad等人（2019）的研究表明，当ELISA的检测时间点和程序略有调整时，LC-MS/MS与ELISA之间的收敛性会出现变化。这一现象被解释为不同批次ELISA试剂盒中多克隆抗体的差异以及不同次数的解冻/冷冻和离心操作导致的基质干扰。这些发现强调了不同实验室在时间与样本处理方面的差异可能带来的方法和检测之间的潜在分歧。

本研究旨在更全面地评估LC-MS/MS、ELISA和RIA等分析技术在唾液激素测量中的有效性与可靠性，并估计这些方法在同一实验室和不同实验室中的表现。具体而言，我们研究了每种方法在检测已知的昼夜节律和月经周期对激素的影响、男性与女性之间自然存在的睾酮比例以及质量控制样本的准确性和回收率方面的适用性与局限性。

为了评估这些方法的性能，我们引入了一些参数。这些参数用于衡量唾液中皮质醇（C）和睾酮（T）检测方法的表现。由于皮质醇和睾酮的水平会随采样时间的不同而变化，并且在个体之间也存在差异，因此我们不比较这些方法与绝对值，而是关注相对激素水平及其变化。在男性和女性中，皮质醇和睾酮表现出不同的昼夜节律。男性和女性的皮质醇水平在清晨达到峰值，随后在一天中逐渐下降，至夜间达到最低点。而睾酮则表现出类似的但更不明显的昼夜节律，因此我们预期在男性和女性中都能检测到皮质醇和睾酮在清晨与傍晚之间的显著差异。

在女性中，皮质醇水平在正常排卵周期（NC女性）和使用口服避孕药（OC女性）的情况下表现出一致性。然而，睾酮水平在排卵期间会略有上升，并在整个卵泡期和黄体期保持相对稳定。因此，我们预期在NC女性和OC女性中，皮质醇和睾酮水平在卵泡期和黄体期之间保持一致。此外，口服避孕药的使用会终止自然的月经周期，同时提高皮质醇水平并降低睾酮水平。因此，我们预期OC女性的皮质醇水平高于NC女性，而睾酮水平则低于NC女性。

质量控制样本可以用来测试检测方法的准确性，从而评估其有效性。准确性由测量的正确性和精确性组成。正确性可以通过测量参考溶液并将其估计值与预期值进行比较来评估。精确性则通过多次重复测量同一样本进行检验。质量控制样本应涵盖检测方法的不同浓度水平，以覆盖其大部分校准范围。在本研究中，质量控制样本被盲法加入到样本集中，以确保检测过程中对这些样本的处理是无偏的。这些样本包括男性和女性唾液样本的重复样本，以及参考溶液的四个稀释级别，以评估精确性和回收率。我们预期重复样本的平均值之间没有显著差异，但两个样本组之间具有高度显著的相关性。对于参考溶液的稀释样本，我们预期回收率在85-115%之间，这是美国食品药品监督管理局（FDA）所接受的标准。

虽然有效性评估的是测量的准确性，但可靠性则显示了结果能否被重复。在本研究中，我们评估了不同实验室与方法组合之间的相关性。目前，尚无通用的标准来确定在唾液激素研究中，两种检测方法之间的相关性水平是否可接受。因此，我们借鉴了类似比较研究的评估结果（如Miller等人，2013；Welker等人，2016），并预先注册了以下标准：如果方法与LC-MS/MS之间的相关性达到或超过r = 0.80，则被认为是具有高收敛有效性的方法。相关性在r = 0.70到r = 0.80之间的方法被认为是可接受但不理想，因此这些方法的结果应被谨慎对待。如果相关性低于r = 0.70（即小于50%的共同方差），则认为这些方法的有效性不足，因此不适合用于唾液激素的测量。基于此前对类似浓度唾液激素的研究，我们假设使用RIA和ELISA检测皮质醇的相关性将超过r = 0.80，而男性睾酮的相关性则预期在r = 0.70到r = 0.80之间，女性睾酮的相关性则预期低于r = 0.70。我们预期在每种方法与激素的组合中，不会出现实验室之间的系统性差异。我们还预期LC-MS/MS对这两种目标激素的测量值会低于RIA或ELISA。对于这两种方法的平均激素水平，我们不预期存在系统性差异。

本研究是来自一项多中心、多方法比较研究的两篇论文中的第一篇，旨在评估唾液激素的检测方法。另一篇论文将涉及唾液中孕酮和雌二醇的检测结果（Dlugash等人，待发表）。本研究聚焦于评估LC-MS/MS、RIA和ELISA等分析技术在唾液皮质醇和睾酮测量中的有效性与可靠性。总共336个样本由这三种方法在四个实验室中进行检测。

每个实验室都收到了一组相同的318个唾液样本分装。这些样本的采集包括了与性别相关的激素波动和昼夜节律，并且对激素避孕药的使用进行了控制。为了确保检测过程的公正性，这些样本在实验室不知情的情况下被加入。样本集中还包括了额外的质量控制样本：14个男性和女性唾液样本的重复样本，以及参考溶液的四个不同稀释级别。这些质量控制样本的加入，有助于全面评估检测方法的准确性和回收率。

通过这种方式，我们希望不仅能够评估不同方法对激素水平的测量能力，还能了解它们在不同实验室中的表现。这种研究方法有助于识别不同实验室之间可能存在的差异，并评估这些差异对研究结果的影响。同时，它也能帮助研究人员更好地理解不同方法在不同条件下的适用性，从而做出更科学的检测选择。

在本研究中，我们还关注了不同方法在检测过程中可能遇到的问题。例如，ELISA和RIA等方法由于其检测原理的局限性，可能会受到其他化合物的干扰，从而影响检测结果的准确性。此外，不同实验室之间的操作差异，如样本处理的时间、离心次数等，也可能对检测结果产生影响。这些因素都可能影响不同方法之间的可比性，因此需要在研究设计中加以考虑。

本研究的结果对于社会神经内分泌学领域具有重要意义。它不仅有助于识别不同检测方法的优缺点，还能为研究人员提供选择合适检测方法的依据。此外，研究结果还可能对临床内分泌学领域产生影响，因为这些方法的准确性对于临床诊断同样重要。通过本研究，我们希望为未来的激素检测研究提供有价值的参考，并推动更标准化和可靠的方法应用于唾液激素的测量。

本研究的实施过程中，我们遵循了严格的伦理规范。研究方案已获得弗里德里希-亚历山大大学纽伦堡-埃尔朗根的机构审查委员会（Nr. 141_17 B）的批准。此外，我们还承诺了开放科学的原则，所有与研究结果相关的数据文件和分析脚本均可在开放科学平台（https://osf.io/x9yqr/files/osfstorage）上获取，以确保研究的透明性和可重复性。

在本研究中，我们还考虑了不同方法在检测过程中可能存在的局限性。例如，ELISA和RIA等方法在检测低浓度激素时可能表现出较低的准确性，而LC-MS/MS虽然在高灵敏度和特异性方面表现优异，但其实施成本较高，需要更高的技术和分析能力。因此，研究人员在选择检测方法时，需要根据研究目的、样本浓度范围以及资源条件进行权衡。同时，还需要关注不同方法在不同实验室中的表现差异，以确保研究结果的一致性和可靠性。

本研究的结果表明，不同方法在检测激素时可能会产生不同的结果。这种差异可能与检测方法本身的特性、实验室的操作条件以及样本的处理方式有关。因此，研究人员在进行激素测量时，需要充分了解这些方法的优缺点，并根据研究的具体需求选择最合适的方法。此外，还需要关注不同方法之间的可比性，以确保研究结果的科学性和可信度。

总的来说，本研究强调了在激素测量中选择合适方法的重要性。不同的方法在不同浓度范围下可能表现出不同的性能，因此研究人员需要根据研究的具体情况，如激素的浓度、研究对象的特征以及资源条件，来选择最合适的检测方法。同时，还需要关注不同实验室之间的操作差异，以确保研究结果的一致性和可靠性。这些发现对于推动更标准化、更可靠的激素检测方法具有重要意义，同时也为未来的激素测量研究提供了有价值的参考。