基于SPME-GC–MS技术的柑橘花蕾挥发性成分分析与品种鉴别研究

本研究针对柑橘品种鉴别中传统形态学方法局限性和分子标记技术成本高、操作复杂的问题，通过SPME-GC–MS技术分析6个柑橘品种花蕾挥发性成分。研究优化萃取条件后鉴定出108种挥发性化合物，筛选出21种关键香气成分（包括3种新型柑橘香气成分），结合PCA、PLS-DA等多元统计方法成功实现品种精准区分，建立了快速可靠的柑橘品种真实性鉴别和品质评估方法。

　　

在柑橘产业蓬勃发展的今天，市场上出现了越来越多以次充好、假冒产地的欺诈行为。消费者缺乏专业鉴别能力，商家则利用品种间的相似性进行替换牟利，这使得柑橘产品的溯源工作变得尤为重要。传统的形态学鉴别方法由于品种数量众多、特征相似，难以区分亲缘关系较近的品种。虽然现代分子标记技术（如SNP和SSR）大大提高了品种鉴别的速度和准确性，但这些技术对设备要求高、操作复杂、成本昂贵，且环境适应性较差，对于具有复杂遗传背景的品种，其分辨能力仍显不足。

正是在这样的背景下，研究人员将目光投向了柑橘的挥发性成分。尽管柑橘品种间遗传相似度高，但其挥发性成分组成却存在显著差异，这种差异为品种鉴别提供了新的可能。挥发性成分的浓度和组成受到遗传、环境和生物因素的共同影响，但研究表明品种本身的挥发性特征具有高度特异性，遗传背景是决定挥发性成分组成的主要因素。相比品种间的遗传差异，环境因素（包括产地）对挥发物的影响要小得多。

固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（SPME-GC–MS）在这方面展现出显著优势：具有高灵敏度和特异性，操作简单快速，无需复杂样品前处理，数据处理能力强，在复杂样品分析中应用前景广阔。不过，该技术的稳定性受到多种实验条件的影响，需要通过优化和标准化实验参数（如萃取时间、温度等）并控制环境因素（如湿度）来确保结果的可靠性。

本研究旨在通过SPME-GC–MS技术鉴定和定量不同柑橘品种花蕾中的挥发性成分，利用主成分分析和聚类分析等多变量统计方法区分不同柑橘品种，分析不同柑橘品种主要香气成分的差异，并构建柑橘挥发性成分图谱。研究成果不仅阐明了柑橘主要香气成分的化学组成和差异，还能根据挥发性成分对不同品种进行分类，提高品种鉴别的准确性，为评价柑橘品质和开发花蕾功能提供理论依据。

研究人员从资源圃采集了6个柑橘品种的花蕾样品，包括胡柚、红心柚、广西蜜柚、明尼奥拉橘柚、里斯本柠檬和沙田柚。每个品种选择5株植株，从不同方向随机采集花蕾并混合成一个样品。样品经液氮速冻后保存于-80°C超低温环境。处理时，将样品在液氮条件下研磨成细粉并通过60目筛网确保粒径均匀。

研究采用单因素完全随机设计，设置了6个品种水平和每个水平6个生物学重复（n=36）。通过单向方差分析优化了SPME的关键参数，包括萃取温度（50、60、70、80°C）、平衡时间（15、20、25、30分钟）、萃取时间（30、40、50、60分钟）和解吸时间（1、2、3、4分钟）。优化实验通过分析总离子流色谱图中的化合物总数（TN）和总峰面积（TA）来评估。

最终确定的最佳条件为：顶空瓶在50°C水浴中平衡25分钟，使用100μm DVB-CAR-PDMS萃取头萃取30分钟，解吸2分钟。为避免样品间干扰，萃取头在使用前进行了预处理和在气相色谱仪上老化3分钟，进样口温度设为250°C以消除残留杂质。

GC-MS分析使用Agilent Technologies 5975C-6890N系统，配备DB-5ms色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）和100μm DVB-CAR-PDMS萃取头。气相色谱条件采用分流模式（分流比10:1），进样口温度250°C解吸2分钟，高纯氦气（纯度>99.999%）作为载气，恒定流速1mL/min。初始温度35°C保持3分钟，然后以5°C/min速率升至200°C保持1分钟。质谱条件包括电子轰击能量70eV，离子源温度230°C，四极杆温度150°C，全扫描模式，质量扫描范围30-450m/z。

挥发性成分通过NIST 2014质谱数据库和保留指数（RI）进行鉴定，只保留匹配因子超过80的物质。RI使用正构烷烃（C₆-C₃₄）在相同色谱条件下计算。数据统计采用Tukey检验（p<0.05）分析挥发性化合物平均值的差异，结果以平均值±标准差表示。使用SIMCA软件进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），基于Ward方法进行层次聚类分析，并通过Myvi云平台进行可视化。

3.1. 不同柑橘品种花蕾的形态特征

研究发现不同柑橘物种间花蕾形态存在差异。里斯本柠檬的花蕾表现出杯状花萼，具4-5个浅裂片，通常单生；外侧呈浅紫红色，内侧为白色，与其他五个品种形成明显对比。胡柚和广西蜜柚的花蕾呈椭圆形，通常为白色或浅绿色。红心柚的花蕾较短，更横向扩大，也呈白色或浅绿色。明尼奥拉橘柚的花蕾通常较小、细长，呈现白色或浅绿色。

3.2. 柑橘花蕾中挥发性化合物的鉴定

研究使用优化的SPME-GC–MS方案分析了六个不同柑橘花蕾的挥发性化合物，通过保留指数（RI）数据库和质谱（MS）数据库共鉴定出108种挥发性化合物。这些化合物根据PubChem数据库进行分类，并使用峰面积归一化法计算了不同柑橘物种花蕾中各化合物的相对含量。

挥发性成分可分为七大类，包括萜类、醛类等。其中萜类在数量上最为丰富，且浓度最高。六个柑橘品种的比较显示，挥发性化合物总数排序为：明尼奥拉橘柚（56种）>红心柚（47种）>沙田柚（46种）>胡柚（41种）>广西蜜柚（38种）>里斯本柠檬（32种）。萜烯是所有物种中最多样化和最丰富的挥发性化合物，这一发现与Zhang等人的报道一致。

尽管不同柑橘花蕾的挥发性成分组成存在差异，但在所有品种中共同鉴定出12种标准成分，均为萜类化合物。d-柠檬烯在里斯本柠檬、胡柚、红心柚和沙田柚中含量最高，分别为54.42%、39.75%、37.06%和21.25%。同时，广西蜜柚和明尼奥拉橘柚中挥发性成分含量最高的物质分别是β-月桂烯（26.21%）和芳樟醇（20.21%）。品种间物质含量的差异为针对性开发提供了基础。

3.3. 柑橘品种挥发物的多元统计分析

主成分分析（PCA）显示每个物种内的生物学重复紧密聚集，表明数据具有足够的重现性用于后续分析。PLS-DA作为一种监督学习方法，通过最大化类间差异构建潜在变量以提高分类性能，被证明比PCA更适合分类任务。

PLS-DA得分图结果表明，不同柑橘品种在花蕾挥发性化合物方面表现出物种特异性。红心柚和明尼奥拉橘柚的样品分别独立聚集在第一和第三象限，表明品种间挥发性化合物组成存在显著变异。广西蜜柚和沙田柚的样品在第二象限紧密聚集，表明这些品种间高度相关。里斯本柠檬和红心柚的样品在第四象限聚集，表明它们的花蕾挥发性化合物高度相似。这些发现进一步证实了挥发性化合物在鉴定柑橘品种方面的有效性。

在PLS-DA载荷图中，接近原点的化合物被屏蔽，留下了14种具有最高判别力的挥发性物质。d-柠檬烯、β-月桂烯和芳樟醇是这些化合物的主要成分，在区分不同柑橘品种方面起着关键作用。热图分析显示了14种核心挥发性物质的浓度分布及其贡献，结果证明这些化合物能够有效区分文中提到的六个柑橘物种。

3.4. 关键香气成分分析

变量投影重要性（VIP）值用于评估多变量分析模型中变量的重要性。通常VIP大于1的挥发性化合物贡献更显著，可视为关键挥发性化合物或关键香气成分。通过PLS-DA分析，从108种化合物中鉴定出21种VIP>1的挥发性化合物，包括19种萜烯、1种酯和1种烃。

在这21种关键香气成分中，18种已被先前研究确认为柑橘的特征香气化合物，而M-伞花烃、(E)-β-法尼烯和Tricyclo[4.4.0.02,7]decane,1-methyl-3-methylene-8-(1-methylethyl)-, (1R,2S,6S,7S,8S)-rel-尚未被主流文献纳入柑橘关键香气成分列表。由于本研究样本量有限，这三种化合物的判别潜力需要在更大规模、多环境和多品种群体中验证，并辅以嗅觉阈值测量和感官组织学实验。

根据气味描述符，VIP值>1定义的12个气味类别构成了21种主要挥发性物质的大部分。为了可视化不同品种的嗅觉特征，研究人员基于VIP>1的气味物质构建了香气轮。尽管大多数气味类别存在于每个品种中，但轮图显示了明显的品种间差异。柑橘类香气在所有花蕾中占主导地位，代表了该属的共同嗅觉骨架。明尼奥拉橘柚与其他品种不同：除了柑橘类基础外，它还含有相当水平的其他几种气味物质，产生了混合、非分层和多维的 profile。琥珀香气在所有其他品种中不存在，仅出现在红心柚中，因此可作为该基因型的诊断性嗅觉标记。胡椒香气在广西蜜柚中异常丰富，明显将其与剩余品种区分开。沙田柚独特地呈现木质、热带绿色萜类和植物木质 nuances，使其与主要定义为由柑橘类香气支持单一次要气味物质的里斯本柠檬和广西蜜柚区分开。

3.4.1. 萜类化合物

萜类化合物被定义为异戊二烯聚合物及其氧化衍生物，表现出不同程度的不饱和度。这些酶在花香形成中起关键作用。本研究结果证实了它们在柑橘花香气中的重要性。对六个不同柑橘品种花蕾中花香挥发物的研究显示，萜类是整体香气的主要贡献者。在鉴定出的21种主要成分中，19种是萜类化合物，且这些萜类化合物的变量重要性值（VIP）均大于1。排除尚未完全表征的化合物，萜类负责柑橘花蕾中最显著的十种风味描述符。其中"柑橘"和"热带绿色、萜类、木质植物"香气最为普遍。值得注意的是，d-柠檬烯被确定为影响柑橘花蕾香气特征的主要萜类，从而显著增强了最终产品的柑橘特性。

α-桉叶烯在红心柚中检测到，其独特的分子结构负责独特的琥珀香气。百里香酚和M-伞花烃是明尼奥拉橘柚独有的：百里香酚赋予凉爽、辛辣的草药百里香香气，而M-伞花烃的香气尚未明确界定。然而，该化合物在本研究范围内被确定为柑橘的关键香气决定因素；它有潜力作为明尼奥拉橘柚的生物标志物。β-没药烯、(E)-α-香柠檬烯和(-)-反式-α-香柠檬烯是里斯本柠檬特有的香气成分，赋予其独特的香脂木质和温暖木质茶香气。

3.4.2. 烃类

在柑橘花蕾中，1,3,3-三甲基三环[2.2.1.02,6]庚烷是唯一VIP值超过1的烃。值得注意的是，这种三环单萜仅在红心柚中检测到，表明其可能作为品种特异性诊断标记。然而，由于缺乏对其气味特征的详细描述，很难仅根据特征香气区分不同柑橘品种。因此，有必要使用SPME-GC–MS技术进行挥发性分析以实现品种准确鉴定。

3.4.3. 酯类

邻氨基苯甲酸甲酯以其特征性的葡萄样果香和橙花香气而突出。Isabel Escriche等人证明该酯可作为认证柑橘单花蜜的挥发性标记物。然而，在本研究中，该酯的存在并非在所有评估的柑橘中普遍存在；仅在广西蜜柚（6.37%）、胡柚（0.53%）、沙田柚（0.42%）和明尼奥拉橘柚（0.08%）中检测到。它的存在赋予这些品种明显的花香属性，并为其花蕾期香气特征增加了嗅觉复杂性。

本研究建立了一个强大的柑橘品种风味分析工作流程，使用SPME–GC–MS技术。在六个柑橘基因型的花蕾中共鉴定出108种挥发性化合物，从中筛选出21种关键气味物质（包括三种新认识的成分）。多元统计（PCA、PLS-DA和层次聚类）有效区分了六个品种，并生成了它们各自的挥发性化学指纹图谱。品种间的区别在挥发性成分的定性组成和相对丰度上显而易见，为快速品种认证和质量评估提供了新的技术途径和理论框架。

需要注意的是，所有样品均在单个收获季节内收集，因此无法评估年际环境变异性。后续研究工作将把采样框架扩展到多个季节和生产区域，旨在验证候选挥发性标记物的稳健性和普适性，从而为柑橘花蕾的功能开发和工业应用建立更全面的数据平台。

该研究不仅为柑橘品种鉴别提供了新的技术手段，也为柑橘花蕾的功能性开发和利用提供了科学依据。通过挥发性成分分析，研究人员能够准确区分不同柑橘品种，这对于保护品种资源、防止市场欺诈、提升产品质量具有重要意义。特别是在当前农产品质量安全日益受到关注的背景下，这种快速、准确的鉴别方法具有重要的实际应用价值。

研究的创新点在于首次系统分析了柑橘花蕾挥发性成分与品种鉴别的关系，发现了3种新的关键香气成分，建立了基于挥发性成分的品种鉴别体系。该方法相比传统方法具有操作简便、成本较低、准确性高的优势，为柑橘产业的质量控制和品种保护提供了新的技术支撑。

未来研究可以进一步扩大样本量和品种范围，验证该方法的普适性，并探索挥发性成分与柑橘品质、风味特性之间的内在联系，为柑橘育种和产品开发提供更多科学依据。同时，可以结合分子生物学技术，深入研究挥发性成分合成的遗传机制，为柑橘品种改良和香气品质提升奠定理论基础。