线叶金雀花（Aspalathus linearis）对氧化应激下人精子保护作用的研究：与抗坏血酸的对比分析

本研究针对氧化应激导致男性不育的关键问题，探讨了发酵与未发酵线叶金雀花（Aspalathus linearis）提取物及抗坏血酸（AA）对人精子功能的保护作用。研究通过体外实验证实，两种形式的线叶金雀花提取物均能显著改善精子活力、运动学参数、线粒体膜电位（MMP），并降低DNA碎片化及活性氧（ROS）水平，其抗氧化效果与AA相当甚至更优。该发现为开发天然抗氧化剂治疗男性不育提供了新的理论依据和实验支持。

　　

男性不育是一个全球性的健康问题，约30-50%的夫妇受其影响，其中男性因素单独导致的不育约占20%，并在近一半的病例中起到重要作用。近年来，男性不育的发病率显著上升，2019年全球报告病例数达到5650万，较1990年增长了76.9%。导致男性不育的主要原因包括精液质量差、激素紊乱、遗传异常以及氧化应激。环境暴露、不健康的生活方式、基础疾病和阴囊温度升高等因素均被证实与精子参数的恶化有关。

氧化应激是由于活性氧（ROS）与抗氧化剂之间的失衡引起的，被认为是男性不育的主要原因，影响近50%的不育男性。升高的ROS水平会损害精子膜完整性、削弱精子活力并诱导DNA碎片化。因此，抗氧化治疗已成为一种潜在的治疗选择，维生素C、E和D、辅酶Q10、锌、硒和肉碱等化合物在改善精子功能和辅助生殖结局方面显示出积极效果。然而，关于最佳抗氧化剂剂量和疗效的证据仍不一致。由于这些不一致性，人们对天然抗氧化剂和植物化合物作为男性不育的替代或补充疗法越来越感兴趣。

在这方面，线叶金雀花（Aspalathus linearis，俗称rooibos）作为一种原产于南非的药用植物，受到了广泛关注。Rooibos作为一种无咖啡因的草药茶，以发酵和未发酵两种形式被消费，由于其口感佳、单宁含量低以及广泛的健康益处而广受欢迎，特别是在孕妇、婴儿和对咖啡因敏感的人群中。其受欢迎程度还得益于其经济性和丰富的抗氧化成分，包括多酚、类黄酮和酚酸，这些成分可作为ROS清除剂。

植物化学分析显示，线叶金雀花含有独特的生物活性化合物，如aspalathin（一种C-连接的二氢查尔酮葡萄糖苷）、aspalalinin（一种环状二氢查尔酮）、槲皮素、儿茶素、原花青素、黄酮和黄烷酮等。特别是aspalathin和nothofagin，已证明其抗氧化活性与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）相当，且未发酵的rooibos通常比发酵形式含有更高浓度的aspalathin。研究表明，rooibos可能对精子参数产生积极影响，包括浓度、活力和存活率。体外研究进一步表明，经rooibos治疗后，不育捐赠者的精子在获能、顶体反应和DNA完整性方面有所改善。然而，也存在矛盾的结果；动物研究中，高剂量和长时间暴露于rooibos与不良反应有关，包括生殖系统改变和肝毒性。

鉴于人们对rooibos作为功能性抗氧化剂的兴趣日益增长，以及其在男性生育力中细胞保护作用尚不明确，本研究旨在评估线叶金雀花和抗坏血酸对暴露于氧化应激的人正常精子（normozoospermic spermatozoa）的保护作用。通过比较它们的功效，本研究试图阐明rooibos在减轻精子氧化损伤方面的潜在治疗用途。

本研究的主要技术方法包括：使用来自25名健康捐赠者的精液样本，通过双密度梯度离心（80%和40%）筛选高活力精子；使用100 μM的枯烯过氧化氢（cumene hydroperoxide）诱导氧化应激；采用计算机辅助精子分析（CASA）系统评估精子运动学参数；使用MiOXSYS系统测量氧化还原电位（ORP）；通过伊红-尼格罗染色评估精子活力；使用二氢乙啶（DHE）荧光染色检测细胞内ROS；采用氯四环素（CTC）荧光测定法评估精子获能和顶体反应；使用JC-1染料测定线粒体膜电位（MMP）；通过TUNEL assay检测DNA碎片化。数据采用GraphPad Prism 10进行统计分析，使用单因素方差分析（ANOVA）和事后检验（Tukey或Sidak）处理。

3.1. 精子运动学参数

研究结果显示，与阳性对照（仅含枯烯过氧化氢）相比，发酵和未发酵rooibos提取物以及抗坏血酸（AA）均能显著改善精子的曲线速度（VCL）、平均路径速度（VAP）、直线速度（VSL）、侧向头部位移幅度（ALH）、直线性（LIN）、摆动性（WOB）、鞭打频率（BCF）和超活化（hyperactivation）等运动学参数（p < 0.05）。发酵rooibos在60和120分钟时显著提高了VAP和VSL，但在210 μg/mL浓度下120分钟后效果不显著（p > 0.05）。未发酵rooibos在两个时间点均显著降低了ALH（p < 0.05）。AA在60分钟时无显著效果，但在10 μg/mL浓度下120分钟后显著提高了VAP和VSL（p < 0.05）。与阴性对照（仅含HTF-BSA培养基）相比，发酵rooibos在2.1至210 μg/mL浓度下60分钟后以及120分钟后均显著降低了VCL（p < 0.05），而未发酵rooibos和AA则在两个时间点显著提高了VCL、VAP、ALH、STR、LIN、WOB、BCF和超活化（p < 0.05）。双向方差分析显示，VCL、VAP、VSL、ALH、超活化和BCF无剂量依赖性时间效应（p > 0.05）。然而，发酵rooibos在两个时间点的VCL和VAP均显著高于AA（p < 0.05）。未发酵rooibos在60和120分钟时表现出浓度依赖性的VAP、VSL和ALH增加，而VCL、STR、WOB和BCF则呈现浓度-时间依赖性下降。

3.2. 总活力和前进活力

与阳性对照相比，发酵和未发酵rooibos在60和120分钟时均显著提高了精子总活力和前进活力百分比（p < 0.05），而AA则无显著效果（p > 0.05）。与阴性对照相比，发酵和未发酵rooibos在两个时间点的总活力和前进活力无显著差异（p > 0.05），但未发酵rooibos在240 μg/mL浓度下120分钟后前进活力显著下降（p < 0.05）。AA与阴性对照相比无显著差异（p > 0.05）。与AA（10–31.25 μM）相比，发酵和未发酵rooibos在60和120分钟时均显示出更高的前进活力百分比（p < 0.05）。发酵rooibos和AA无显著的浓度或时间依赖性效应（p > 0.05），但未发酵rooibos在60至120分钟间表现出时间依赖性的前进活力下降（p < 0.05）。

3.3. 氧化还原电位测量

阴性对照的ORP和静态ORP（sORP）均低于阳性对照（p < 0.0001）。与阳性对照相比，发酵和未发酵rooibos水提取物以及AA均显著降低了sORP（p < 0.0001），其中0.21 μg/mL（发酵）和0.24 μg/mL（未发酵）浓度的ORP和sORP最高。AA在10 μM浓度下显著降低了ORP和sORP（p < 0.0001）。此外，AA的ORP和sORP均低于两个处理组（p < 0.05）。

3.4. 精子活力

与阳性对照相比，发酵和未发酵rooibos以及AA在60和120分钟时均显著提高了精子活力（p < 0.0001）。与阴性对照相比，发酵rooibos在60分钟时活力显著增加（p < 0.05），但在120分钟时下降（p < 0.05）。未发酵rooibos在0.24和240 μg/mL浓度下60分钟时活力显著增加（p < 0.001），但在2.4和24 μg/mL浓度下无显著效应（p > 0.05）。在120分钟时，未发酵rooibos显示出比阴性对照更高的活力百分比（p < 0.05）。AA与阴性对照相比无显著差异（p > 0.05）。与AA（10–31.25 μM）相比，发酵rooibos在60分钟时显著提高了活力（p < 0.01），但在120分钟时与10 μM相比下降（p < 0.05），与31.25 μM相比无显著性（p > 0.05）。未发酵rooibos在0.24和240 μg/mL浓度下显示出比10 μM AA更高的活力（p < 0.05），但在2.4和24 μg/mL浓度下无显著性。在60分钟时，未发酵rooibos与31.25 μM AA相比显著提高了活力（p < 0.05）。发酵和未发酵rooibos均表现出浓度和时间依赖性的活力下降（p < 0.05），而AA则呈现浓度和时间依赖性的增加（p < 0.05）。

3.5. 活性氧

与阳性对照相比，发酵和未发酵rooibos以及AA均显著降低了ROS阳性精子的百分比（p < 0.0001）。与阴性对照相比，发酵rooibos在2.1、21和210 μg/mL浓度下显著降低了ROS阳性精子（p < 0.05），但在0.21 μg/mL浓度下无显著变化。相反，未发酵rooibos在0.24 μg/mL浓度下显著增加了ROS阳性精子（p < 0.05），在2.4、24和240 μg/mL浓度下无显著变化（p > 0.05）。AA与阴性对照相比无显著差异（p > 0.05）。与AA（10–31.25 μM）相比，发酵rooibos在0.21 μg/mL浓度下显示出更高的ROS阳性精子（p < 0.05），而在2.1、21和210 μg/mL浓度下水平较低（p < 0.05）。未发酵rooibos在0.24和2.4 μg/mL浓度下显示出更高的ROS阳性精子（p < 0.05），在24和240 μg/mL浓度下无显著差异（p > 0.05）。随着发酵和未发酵rooibos浓度的增加，ROS阳性精子呈现浓度依赖性下降（p < 0.05），而AA无显著趋势（p > 0.05）。

3.6. DNA碎片化

与阳性对照相比，发酵、未发酵rooibos和AA均显著降低了DNA碎片化（p < 0.05）。然而，所有处理组与阴性对照相比均显示出DNA碎片化的显著增加（p < 0.05）。与AA（10–31.25 μM）相比，发酵rooibos显示出DNA碎片化的显著减少（p < 0.0001），但在0.21和210 μg/mL浓度下与10 μM相比无显著性（p > 0.05）。未发酵rooibos在2.4和240 μg/mL浓度下与10 μM AA相比显著增加了DNA碎片化（p < 0.0001）。与31.25 μM AA相比，未发酵rooibos在0.24 μg/mL浓度下显著增加了DNA碎片化（p < 0.05），而在24 μg/mL浓度下显著减少（p < 0.05），在2.4和240 μg/mL浓度下无显著变化（p > 0.05）。发酵rooibos在0.21至2.1 μg/mL浓度间呈现剂量依赖性的DNA碎片化下降（p < 0.05），未发酵rooibos在0.24至240 μg/mL浓度间也呈现剂量依赖性下降（p < 0.001）。值得注意的是，AA随着浓度的增加，呈现依赖性的DNA碎片化精子百分比增加（p < 0.05）。

3.7. 线粒体膜电位

与阳性对照相比，发酵和未发酵rooibos以及AA均显著提高了具有完整线粒体膜电位（MMP）的精子百分比（p < 0.0001）。发酵rooibos在2.1、21和210 μg/mL浓度下显著增加了完整MMP的百分比（p < 0.01），但在0.21 μg/mL浓度下下降。未发酵rooibos在24和240 μg/mL浓度下显著增加了完整MMP，但在0.24和2.4 μg/mL浓度下下降（p < 0.05）。AA处理组随着浓度的增加呈现剂量依赖性的下降（p < 0.05）。与AA（10 μM）相比，两种rooibos均显示出完整MMP的下降（p < 0.05），但发酵rooibos在21和210 μg/mL浓度下以及未发酵rooibos在240 μg/mL浓度下无显著差异（p > 0.05）。相反，与AA（31.25 μM）相比，发酵rooibos在2.1、21和210 μg/mL浓度下以及未发酵rooibos在24和240 μg/mL浓度下显示出显著更高的完整MMP百分比（p < 0.05），但发酵rooibos在0.21 μg/mL浓度下无显著性（p > 0.05）。发酵和未发酵rooibos均呈现剂量依赖性的完整MMP增加（p < 0.05），而AA则呈现剂量依赖性的下降（p < 0.0001）。

3.8. 获能与顶体反应

与阳性对照相比，发酵和未发酵rooibos以及AA均显著提高了顶体反应精子的百分比（p < 0.05）。与阴性对照相比，发酵rooibos显示出显著更高的顶体反应精子百分比（p < 0.0001），但在210 μg/mL浓度下无显著性（p > 0.05）。相反，未发酵rooibos和AA与阴性对照相比显著降低了顶体反应精子（p < 0.01）。与AA（10–31.25 μM）相比，发酵rooibos显示出显著更高的顶体反应精子百分比（p < 0.0001）。未发酵rooibos在240 μg/mL浓度下与31.25 μM相比也显示出更高的百分比（p < 0.001），但在10 μM下或0.24、2.4和24 μg/mL浓度下无显著差异（p > 0.05）。随着发酵rooibos浓度的增加，顶体反应精子呈现剂量依赖性下降（p < 0.05），而未发酵rooibos则呈现显著的剂量依赖性增加（p < 0.05）。

本研究通过详细的体外实验证实，线叶金雀花（Aspalathus linearis）的发酵和未发酵提取物以及抗坏血酸（AA）均能有效保护人类精子免受氧化应激损伤，改善精子功能参数，并降低氧化还原电位（ORP）和DNA碎片化。其中，rooibos提取物的抗氧化效果与AA相当，甚至在某些参数上表现更优。这些发现为开发天然抗氧化剂治疗男性不育提供了新的理论依据和实验支持，具有重要的临床意义和应用前景。然而，研究也指出，rooibos提取物的剂量至关重要，高浓度可能产生细胞毒性作用，因此在实际应用中需谨慎控制剂量。未来的研究应进一步探讨rooibos在诊断患有氧化应激相关不育患者中的直接效果，以验证其临床适用性。