推进犀牛疾病监测：一种用于检测双角泰勒虫（Theileria bicornis）和双角巴贝斯虫（Babesia bicornis）的多重实时PCR检测方法

《Ticks and Tick-borne Diseases》：Advancing disease surveillance in rhinoceroses: A multiplex real-time PCR assay for detecting Theileria bicornis and Babesia bicornis

多重qPCR检测方法在犀牛血液原虫诊断中的应用与评估，通过开发MqTbBb方法实现Theileria bicornis和Babesia bicornis的同步检测与定量分析，灵敏度达1.00×10??%和6.27×10??%等效寄生红细胞，特异性优于传统RLB方法。223份样本显示黑犀牛97%感染T. bicornis且40%共感染，白犀牛99%感染T. bicornis但无B. bicornis单独感染。

　　黑犀牛（*Diceros bicornis*）和白犀牛（*Ceratotherium simum*）在非洲南部面临着多种威胁，包括盗猎、栖息地丧失以及迁移过程中的应激反应。此外，这两种犀牛都可能感染*Theileria bicornis*，而*Theileria bicornis*和*Babesia bicornis*的感染进一步增加了它们的健康风险。应激因素如迁移可能会增加感染的易感性，因此有效的管理需要敏感的分子诊断方法以实现准确的检测和监测。为了解决这一问题，研究团队开发了一种多重qPCR检测方法（MqTbBb），利用种特异性TaqMan?小沟结合（MGB）探针，同时检测*Theileria bicornis*和*Babesia bicornis*。该检测方法针对18S rRNA基因区域，扩增出87 bp的片段用于*Theileria bicornis*，以及51 bp的片段用于*Babesia bicornis*，其效率分别为100%和98%。通过Probit分析确定了检测限，对于*Theileria bicornis*和*Babesia bicornis*分别为1.00 × 10??%和6.27 × 10??%等效被感染红细胞百分比。没有观察到与其他相关原生动物的交叉反应。总共对来自南非姆普姆兰加省的223个犀牛样本（101个黑犀牛和122个白犀牛）进行了筛查，使用了MqTbBb和反向线杂交（RLB）两种检测方法。MqTbBb检测到*Theileria bicornis*在57%的黑犀牛和99%的白犀牛中存在，其中40%的黑犀牛样本存在共感染。RLB检测到*Theileria bicornis*在96%的黑犀牛和95%的白犀牛中存在，而*Babesia*的通用探针信号在75%的黑犀牛和32%的白犀牛中被观察到。然而，*Babesia bicornis*未被RLB检测到，并且从未被qPCR单独检测到。这些发现突显了*Theileria bicornis*的高流行率和*Babesia bicornis*的罕见感染（共感染）。MqTbBb检测方法增强了检测、监测和保护工作。

国际自然保护联盟（IUCN）将黑犀牛列为极度濒危物种，而白犀牛则列为近危物种。在非洲南部，黑犀牛和白犀牛是本地物种，保护工作对于维持区域生物多样性至关重要。过去二十年，南非的黑犀牛数量有所增加，但盗猎、栖息地丧失和迁移相关压力仍然是主要威胁。许多犀牛现在被管理在围栏保护区、保护区域或高强度保护区中。迁移虽然对于维持基因多样性及管理种群至关重要，但可能会导致慢性压力，从而引发免疫抑制和增加感染风险。迁移过程中，动物可能会暴露于新的病原体，或在未受影响的区域传播新的感染。这种压力与犀牛的死亡率有关，尤其是在感染如 babesiosis 的情况下。

*Theileria bicornis* 和 *Babesia bicornis* 是影响犀牛的重要病原体。这些血源性原生动物寄生虫通过硬蜱传播，感染了全球范围内的野生动物和家畜。*Theileria bicornis* 在白犀牛和黑犀牛中均有报道，而*Babesia bicornis*至今仅在黑犀牛中被确认。虽然许多感染是无害的，但迁移或过度拥挤等应激事件可能导致免疫系统受到抑制，从而触发寄生虫的繁殖，并在某些情况下导致死亡。*Babesia* 物种首次在肯尼亚的黑犀牛中被报道是在1967年。在1967年至1969年期间，南非夸祖鲁-纳塔尔省（KZN）在迁移事件中对麻醉的白犀牛进行血液涂片分析，发现34只动物感染了较小的*Theileria*物种，而两只雌性幼崽感染了较大的*Babesia*物种。2003年，对四只黑犀牛死亡的分子研究确认了这些寄生虫的存在，即*Theileria bicornis*和*Babesia bicornis*。*Babesia bicornis*与三只犀牛的死亡有关，并且在南非大鱼河保护区的五只健康的黑犀牛中也发现了其存在。随后的分子研究表明，非致病性的*Theileria bicornis*在南非和肯尼亚的白犀牛和黑犀牛中广泛存在。

对*Theileria bicornis* 18S rRNA基因的遗传分析揭示了四种单倍型（H1–H4），这些单倍型在白犀牛和黑犀牛中均有发现。尽管*Theileria bicornis*通常被认为是非致病性的，但由于缺乏确凿的证据，其在迁移后可能导致犀牛的发病率和死亡率。肯尼亚犀牛种群中*Theileria bicornis*的单倍型鉴定突显了遗传多样性，并表明在迁移未感染动物时应谨慎。*Theileria bicornis*也曾在其他物种中被报道，包括牛羚（*Tragelaphus angasii*）、高角羚（*Aepyceros melampus*）、黑斑羚（*Hippotragus niger*）和eland（*Tragelaphus oryx*）中发现，尽管这些发现可能反映了诊断限制，而非真正的宿主可塑性。

分子检测方法，如反向线杂交、嵌套和常规PCR、克隆和测序等，已显著提高了犀牛血源性寄生虫的检测能力，提供了关于流行率和分布的见解。2003年至2006年期间，对克鲁格国家公园（KNP）中195只白犀牛的研究报告了*Theileria bicornis*感染率为36.4%，*Theileria equi*感染率为9.2%，而*Babesia bicornis*未被检测到。在黑犀牛种群中，分子筛查发现*Theileria bicornis*感染率为42.1%，*Babesia bicornis*感染率为15.8%，*Theileria equi*感染率为5.3%。虽然这些方法提高了寄生虫的检测和特征分析，但它们在常规诊断中的局限性仍然存在。

迁移前的筛查对于犀牛的保护至关重要，但现有的分子诊断方法，如常规PCR和反向线杂交，往往受到其无法量化寄生虫载量和易受污染的限制。为了克服这些限制，本研究开发了一种多重qPCR检测方法（MqTbBb），使用种特异性TaqMan? MGB探针，以同时检测和量化*Theileria bicornis*和*Babesia bicornis*感染。定量PCR已被成功应用于其他血源性寄生虫，其在犀牛寄生虫检测中的应用预计能够实现快速准确的检测，从而促进流行病学研究，并生成关键的诊断数据，以更好地指导保护管理策略。

研究团队获得了比勒陀利亚大学动物伦理委员会（AEC）和研究伦理委员会（REC）的伦理批准（REC030–24），并从比勒陀利亚大学的生物库（BMTA 012/23）和Care for Wild犀牛保护区（CfW）获取了EDTA血液样本。这些样本包括来自克鲁格国家公园不同区域的白犀牛和黑犀牛，包括Skukuza、Malelane、Stolznek、Tshokwane、Houtboschrand、N'wanetsi、Satara、Lower Sabie、Pretoriuskop、Crocodile Bridge、Letaba和Kingfisherspruit。样本包括成年、亚成年和幼年个体，涵盖两种性别。采样主要在去角、动物迁移和枪伤临床管理期间进行。此外，从CfW获取的样本包括24只白犀牛和3只黑犀牛，这些动物在采样时被暂时安置在围栏中。

从每个EDTA血液样本中提取了基因组DNA，使用PureLink? Genomic DNA Kit（Invitrogen, ThermoFisher Scientific, USA）按照制造商的说明进行。研究团队使用了RLB杂交方法，通过设计针对*Theileria*和*Babesia*物种的引物（RLB-F2和RLB-R2），对18S rRNA基因的V4高变区进行扩增。扩增后的产物通过RLB杂交方法进行分析。所使用的寡核苷酸探针在表1中详细列出。

研究团队利用TaqMan? MGB探针设计了用于检测*Theileria bicornis*和*Babesia bicornis*的qPCR方法。从GenBank中检索了35个*Theileria bicornis*的18S rRNA基因序列和5个*Babesia bicornis*的序列，并使用BioEdit Sequence Alignment Editor（Hall, 1999）进行比对。通过识别保守区域，设计了实时PCR引物和探针。在分析特异性时，使用BLAST（NCBI）进行了在线评估。*Theileria bicornis*的qPCR检测出87 bp的片段，而*Babesia bicornis*的qPCR检测出51 bp的片段，均位于18S rRNA基因的V4高变区。引物和探针序列在表2中列出。

单plex检测方法首先在QuantStudio? 5 Real-Time PCR System（Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, USA）上进行了优化，使用Micro-Amp光学96孔反应板。每个10 μl反应包含1X KAPA Probe Fast Universal Master Mix（KAPA Biosystems, Merck）、0.25 μM每种引物、0.125 μM TaqMan? MGB探针和2.5 μl目标DNA。扩增条件包括初始变性95°C 20秒，随后进行45个扩增循环，每个循环包括95°C 1秒和60°C 30秒。优化后的单plex检测方法被组合到MqTbBb多重格式中，以同时检测两种寄生虫。多重检测方法中，每种引物对的浓度为0.25 μM，探针TbicqPr677和BbicqPr602的浓度为0.125 μM。

通过使用合成的GeneArt Strings DNA Fragments（ThermoFisher Scientific?, South Africa）确定了每个单plex检测方法的分析灵敏度，这些DNA片段含有针对*Theileria bicornis*或*Babesia bicornis*的18S rRNA基因片段。每种合成片段的DNA浓度使用Xpose?分光光度计（Trinean, Belgium）进行量化，并调整至10 ng/μl。随后制备了从101?到101 copies/μl的十倍连续稀释系列。基于计算的拷贝数，将基因组等效物每微升的DNA转换为%寄生虫载量（%等效被感染红细胞；PE），假设每微升犀牛血液中有7.35×10?个红细胞。qPCR对标准稀释系列（1.55×10?到1.55×10?? %等效PE）进行了重复三次，并在三个独立的实验中进行。从每个实验中生成的数据用于计算定量循环（Cq）与log %等效PE之间的线性回归方程，从而确定检测方法的效率（Bustin et al., 2009）。

对于多重检测方法（MqTbBb），将*Theileria bicornis*和*Babesia bicornis*的等摩尔量的GeneArt strings DNA，每种10 ng/μl混合，制备了从10?到10?1 copies/μl的十倍连续稀释系列。qPCR对标准稀释系列（1.55×10?到1.55×10?? %等效PE）进行了六次重复，每次三份样本。从六次重复实验中获得的平均Cq值被绘制在log % PE上，生成线性回归方程，从而确定MqTbBb检测方法的扩增效率。为了确定检测方法的检测限（LOD），使用SPSS Statistics v25（IBM Analytics, USA）进行了Probit回归分析。制备了从1.55×10?? %等效PE开始的两倍连续稀释系列，共15个稀释，每个稀释进行了四次独立实验，总共得到16个观察结果。在每个稀释中，正响应的比例通过Probit分析估计，以确定对应于95%检测限的浓度（%等效PE）。

分析特异性时，使用了非目标原生动物寄生虫的DNA，包括*Theileria equi*、*Theileria taurotragi*、*Theileria velifera*、*Babesia bigemina*、*Babesia caballi*和*Babesia microti*。每个实验包括两个阴性对照：从使用RLB杂交检测为阴性的犀牛样本中提取的DNA，以及无模板对照（NTC）。

为了评估MqTbBb检测方法的有效性，研究团队对223个现场样本进行了筛查，以确定*Theileria bicornis*和*Babesia bicornis*的存在。研究团队还比较了RLB杂交和MqTbBb检测方法在检测*Theileria bicornis*和*Babesia bicornis*方面的结果。使用Kappa系数评估了两种检测方法之间的协议程度。对于*Theileria bicornis*，MqTbBb检测方法检测出219个阳性样本，而RLB检测方法检测出213个阳性样本。两种方法之间的协议为97%（217个样本），对应的Cohen’s Kappa值为0.560，表明中度协议。对于*Babesia bicornis*，MqTbBb检测方法检测出40个阳性样本，而RLB检测方法基于*Babesia*属通用探针的杂交检测出115个阳性样本。由于RLB探针未确认*Babesia bicornis*的特异性，这些结果可能代表其他*Babesia*物种。因此，直接比较两种方法的结果无法得出关于*Babesia bicornis*特异性检测的明确结论。相反，qPCR检测方法的高特异性表明，它能够准确识别物种水平，从而减少分类错误的风险。

在研究中，对223个黑犀牛和白犀牛样本进行了筛查，发现*Theileria bicornis*在97%的黑犀牛和99%的白犀牛中存在，而*Babesia bicornis*在黑犀牛中占40%，在白犀牛中未被检测到。这些结果与之前关于*Babesia bicornis*在白犀牛中检测率较低的报道一致，表明宿主特异性感染的可能性，这可能与免疫反应、蜱暴露或媒介偏好有关。在黑犀牛中，*Theileria bicornis*的高流行率特别令人担忧，因为潜伏的寄生虫载量和共感染可能会在迁移或其他高强度管理活动中加剧应激相关的发病率。

共感染在18%的样本中被识别，其中黑犀牛中发生率高达40%。这些发现表明了两种寄生虫在不同物种间的分布不均，这可能受到免疫学和生态学因素的影响。例如，黑犀牛的取食行为可能使其更容易接触到某些蜱虫，而白犀牛的取食行为可能减少这种接触。尽管共感染的临床意义尚不明确，但在应激条件下，如捕捉、迁移或受伤，它们可能对整体健康状况产生影响。

研究结果与之前的发现一致，显示在不同年龄组或性别中，*Theileria bicornis*和*Babesia bicornis*的流行率没有显著差异。然而，对于*Babesia bicornis*，幼年黑犀牛的感染率略高（31.3%），尽管这一差异未达到统计学显著性。这一结果与之前关于白犀牛的研究不同，那些研究指出感染率在亚成年阶段达到峰值。对于幼年犀牛，更高的感染率可能反映了母体抗体的减弱和获得性免疫反应的不完全发展。

综合来看，不同群体中一致的感染率和在无临床症状下的高寄生虫流行率支持了克鲁格国家公园中寄生虫的内生稳定性假说。这表明持续暴露于感染媒介有助于维持寄生虫的高背景流行率，而不会导致临床疾病。

MqTbBb检测方法证明了其在检测*Babesia bicornis*方面的高特异性，相较于RLB-PCR方法，其在*Babesia bicornis*检测中的低Cohen’s Kappa值（κ = 0.200）突显了RLB方法在区分*Babesia*物种方面的有限能力，这可能归因于*Babesia*通用探针的非特异性交叉反应。相反，qPCR检测方法的设计使得在物种水平上能够精确识别，从而降低了分类错误的风险。

在黑犀牛中，共感染的发生率显著高于总体样本（40% vs 18%），这表明可能存在迁移相关的因素、易感性差异或行为模式的不同。这些发现强调了需要进一步了解影响犀牛种群间寄生虫传播动态的生态和宿主相关因素。

综上所述，MqTbBb qPCR检测方法为野生动物疾病监测提供了重要的进展，允许在迁移事件前对这些血源性寄生虫进行定量检测和区分。这对于黑犀牛尤为重要，因为它们更常感染可能致病的*Babesia bicornis*。虽然这些感染在正常条件下可能保持无症状，但应激可能引发免疫抑制，导致潜伏的寄生虫载量发展为急性疾病。由于应激性干预在犀牛保护中往往是必要的，潜伏的感染可能会引发健康危机、降低迁移成功率或导致意外死亡，从而影响保护成果。未来的研究应着重于确定*Theileria bicornis*和*Babesia bicornis*感染的临床相关性，特别是在可能削弱宿主免疫力的条件下。有效管理非洲南部的犀牛迁移需要深入了解蜱传疾病流行病学。通过识别传播媒介、增强基础流行病学数据并采用先进的诊断检测方法，保护者可以制定更加明智的策略，以确保犀牛种群在新环境中的健康和生存。