构建五基因缺失减毒沙门氏菌株SD01ΔMg：一种安全高效的肠炎沙门氏菌活疫苗候选株的开发与评价

本研究针对肠炎沙门氏菌(S. enteritidis)感染导致的禽类健康问题及抗生素耐药性挑战，通过基因编辑技术构建了asd、crp、rfaL、rffG和rfbB五基因缺失减毒株SD01ΔMg。研究证实该突变株毒力显著降低（LD50提高10倍），同时能诱导强烈的体液免疫（IgG）、黏膜免疫（IgA）和细胞免疫（IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α）反应，对高剂量野生菌攻击提供80%保护率。该研究为开发安全高效的新型减毒活疫苗提供了重要理论基础和实践依据。

　　

肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)是全球范围内重要的食源性人畜共患病原体，不仅导致禽类严重疾病造成巨大经济损失，还可通过污染肉蛋产品进入人类食物链引发公共卫生危机。据世界卫生组织统计，沙门氏菌病位居全球腹泻病前四位，在发达国家更是占食源性疾病病例的40%以上。近年来中国多地频发肠炎沙门氏菌感染事件，其在禽类中的流行率持续攀升，成为养殖业面临的严峻挑战。抗生素滥用导致耐药菌株涌现，使得传统防控手段效果日益受限。疫苗接种虽是最有效的预防策略，但传统灭活疫苗免疫原性不佳，而现有减毒活疫苗又存在毒力回复风险，亟需开发新型安全高效的疫苗候选株。

在此背景下，山东农业大学兽医公共卫生研究团队在《Veterinary Vaccine》发表论文，报道了一种通过多基因缺失策略构建的减毒肠炎沙门氏菌株SD01ΔMg，系统评价了其安全性与免疫保护效果。研究人员采用等位基因交换技术依次敲除了asd（天冬氨酸β-半乳糖苷酶基因）、crp（环腺苷酸受体蛋白基因）、rfaL（LPS核心蛋白合成基因）、rffG（表面多糖基因簇启动区基因）和rfbB（LPS O抗原合成基因）五个关键基因。研究使用临床分离株SD01为亲本株，通过接合转移和同源重组技术成功构建突变株，并利用蜡螟幼虫和小鼠模型进行毒力评价，通过鸡胚感染模型测定LD₅₀，采用细胞侵袭实验（HeLa和RAW264.7细胞）评估细菌侵袭能力，通过ELISA检测血清IgG和肠道IgA抗体水平，采用荧光定量PCR分析细胞因子表达，并开展组织病理学观察。

3.1. 构建缺失突变株SD01ΔMg

研究人员成功构建了五基因缺失突变株，测序验证确认基因敲除准确无误，获得了一株具有营养缺陷型（DAP依赖）和毒力减弱的候选疫苗株。

3.2. 突变株生长曲线

生长动力学分析显示SD01ΔMg与野生株生长速率无显著差异，表明基因缺失未影响细菌基本生长能力。

3.3. 生化特性

生化鉴定表明突变株保留了沙门氏菌典型生化特征，与商业疫苗株Sm24/Rif12/Ssq和野生株一致。

3.4. 细胞侵袭能力下降

突变株在HeLa和RAW264.7细胞中的黏附、侵袭和增殖能力显著降低4-8倍（p<0.01），随时间推移缺陷愈发明显。

3.5. 蜡螟模型存活率提升

在10⁶ CFU剂量下突变株使蜡螟存活率提高1.5倍，在更低剂量（10⁵和10⁴ CFU）下改善更为显著。

3.6. 小鼠模型毒力减弱

SD01ΔMg感染小鼠死亡时间延迟（第9天 vs 第7天），临床表现明显减轻，显示毒力显著减弱。

3.7. 粗糙型表型确认

通过盐凝集和结晶紫染色实验证实突变株转变为粗糙型，菌落形态不规则，边缘不光滑。

3.8. 雏鸡毒力评价

雏鸡口服感染显示突变株LD₅₀为6.629×10⁹ CFU，较野生株（7.038×10⁸ CFU）提高近10倍，表明毒力显著减弱。

3.9. 体内定植能力

突变株在肝脏、脾脏和肠道中的定植能力显著降低，接种后第13天器官中已无法分离到细菌。

3.10. 肝脾细菌载量

突变株组和商业疫苗组肝脾细菌载量均较攻击对照组显著降低3倍。

3.11. 体重变化

免疫组体重增长正常，而攻击对照组出现显著生长迟缓，平均体重减少约80克。

3.12. 体液和黏膜免疫应答

二次免疫后血清IgG和黏膜IgA水平显著升高，两周后达到峰值，反应趋势与商业疫苗株一致。

3.13. 细胞因子表达

免疫后IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α表达显著上调（p<0.01），IL-1β在免疫初期升高后逐渐下降。

3.14. 组织病理学观察

突变株免疫组器官组织结构正常，而野生株感染组出现肠黏膜上皮脱落、肝细胞坏死和脾淋巴细胞减少等病理变化。

研究结论表明，五基因缺失减毒株SD01ΔMG成功实现了毒力减弱与免疫原性保留的理想平衡。基因缺失不仅显著降低了细菌侵袭力和器官定植能力（LD₅₀提高10倍），还成功诱导了全面的免疫应答，包括体液免疫（IgG）、黏膜免疫（IgA）和细胞免疫（多种细胞因子）。特别重要的是，该突变株表现出良好的安全性特征：asd基因缺失导致的DAP营养缺陷型确保细菌在自然环境中无法存活，避免了环境扩散风险；crp基因缺失使细菌失去在动物体内获取cAMP的途径，从根本上消除了毒力回复的可能性。

讨论部分强调，脂多糖(LPS)相关基因（rfaL、rffG、rfbB）的缺失不仅减弱了毒力，还可能通过增加外膜蛋白暴露而增强交叉保护免疫反应。这种多基因缺失策略相比单基因缺失具有更高安全性，其中asd和crp基因的双重缺失已被证明能稳定外源基因表达并提高LD₅₀。与商业疫苗株Sm24/Rif12/Ssq相比，SD01ΔMG表现出相当的免疫保护效果（80%保护率）和更低的器官定植，显示其作为新型疫苗候选株的优越潜力。

该研究的重要意义在于为解决肠炎沙门氏菌感染提供了新型疫苗开发策略。多基因缺失减毒株不仅安全有效，其营养缺陷型特性还避免了环境残留风险，符合现代疫苗安全标准。研究结果为开发针对肠炎沙门氏菌及其他沙门氏菌血清型的交叉保护疫苗奠定了坚实基础，对保障禽类健康和食品安全具有重要实践价值，同时为其他人畜共患病疫苗研发提供了可借鉴的技术路线。