自由生活阿米巴作为人类诺如病毒和腺病毒的潜在储存库与运输载体：对水传播病原体环境持久性的新认知

本研究针对自由生活阿米巴(FLA)作为人类诺如病毒(HNoV)和腺病毒(HAdV)的环境储存库与运输载体展开深入探讨。研究人员通过qPCR、荧光显微镜和电镜技术证实了病毒在阿米巴胞质、空泡及细胞核内的定位，发现完整病毒颗粒可在FLA滋养体、包囊和胞外囊泡中持续存在达12天，且HAdV在细胞内持久性后仍保持感染性。该发现揭示了FLA对肠道病毒的环境保护机制，对污水处理工艺评估和饮用水安全标准修订具有重要指导意义。

　　

在全球范围内，食源性和水源性疾病仍然是发展中国家和发达国家面临的重要公共卫生挑战。人类诺如病毒(Human Norovirus, HNoV)和人类腺病毒(Human Adenovirus, HAdV)作为急性病毒性胃肠炎的主要病原体，通过粪-口途径在环境中传播，其低感染剂量和高环境持久性使得防控工作尤为困难。更令人担忧的是，近年来研究发现这些肠道病毒能够存在于环境中的自由生活阿米巴(Free-Living Amoebae, FLA)体内，这为病毒在环境中的存活和传播提供了新的可能途径。

FLA是一类广泛存在于自然水体和人造水系统中的单细胞真核原生动物，包括Vermamoeba vermiformis、Acanthamoeba polyphaga和Willaertia magna等常见物种。它们以细菌为食，能够在不利环境下形成具有极强抗性的包囊，对紫外线、氯消毒等常规水处理手段表现出显著的抵抗力。研究表明，FLA不仅是某些细菌（如军团菌）的天然宿主，还可能作为病毒的环境储存库和运输载体。

为了深入探究FLA与肠道病毒的相互作用机制，研究人员开展了一项系统性的实验研究。该研究以三种常见的FLA物种（V. vermiformis、A. polyphaga和W. magna）为模型，分别与HNoV GII.4型和HAdV40/41型进行共培养，通过多种先进技术手段分析了病毒在阿米巴体内的定位、持久性和感染性变化。

研究采用了定量聚合酶链反应(qPCR)、荧光显微镜、透射电子显微镜(TEM)和ImageStream流式细胞术等关键技术方法。病毒样本来源于临床粪便样本和细胞培养物，其中HAdV40/41株系和Buffalo Green Monkey (BGM)细胞由加拿大阿尔伯塔省公共卫生实验室提供。研究人员还应用了整合细胞培养-qPCR (ICC-qPCR)和PMA-衣壳完整性-qPCR (PMA-ci-qPCR)等特异性检测方法评估病毒活性。

3.1. HNoV对FLA生长率的潜在 adverse effects

通过血细胞计数仪对三种FLA与HNoV共培养后的生长情况进行定量分析，结果显示与未暴露于病毒的对照组相比，所有共培养的阿米巴在6天实验期内均未出现显著数量下降，表明病毒内化对阿米巴生长没有明显影响。

3.2. HNoV在FLA中的持久性

qPCR分析显示，与FLA共培养的HNoV基因组浓度在5天内保持稳定，而游离病毒颗粒则缓慢减少。这表明HNoV在阿米巴体内避免了作为食物源被消化，而是保持了其完整性。

3.3. TEM分析

透射电镜观察发现在V. vermiformis和A. polyphaga的细胞质中存在聚集的病毒样颗粒，这些颗粒呈二十面体形状，尺寸与完整HNoV病毒粒子(30-40 nm)相符。在W. magna中观察到HAdV病毒颗粒不仅存在于细胞质中，还突破了核膜屏障进入阿米巴细胞核内。

3.4. ImageStream流式细胞术

通过结合流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜技术，研究人员证实了HNoV在所有三种FLA物种中的内化现象，以及HAdV在W. magna细胞核内的定位。荧光染色显示病毒颗粒存在于阿米巴滋养体、包囊和胞外囊泡中。

3.5. 衣壳完整性和mRNA qPCR检测HAdV复制活性

通过对hexon基因区和纤维蛋白相关mRNA的分子检测，发现感染性HAdV共培养物在12天内维持并增加了基因组拷贝数，而热灭活病毒信号强度则逐渐降低。mRNA的持续存在表明病毒在阿米巴体内可能启动了与复制相关的转录活动。

研究结论表明，FLA作为HNoV和HAdV的环境储存库和运输载体，能够为这些病毒提供额外的保护层，帮助它们抵御环境压力和工程消毒过程。病毒在阿米巴体内的持久性甚至潜在的复制能力，对当前污水处理和饮用水生产中的病毒去除率假设提出了挑战。

这一发现具有重要的公共卫生意义。首先，它要求重新评估现有水和卫生指南，以更好地减轻环境传播途径。其次，考虑到FLA在自然和工程水系统中的普遍存在，这种病毒-阿米巴相互作用可能会影响娱乐用水（特别是在污水影响的河流和湖泊中）以及水回用应用中的微生物风险评估。

此外，研究结果还对使用HAdV作为水质指标的传统观念提出了质疑。以往认为HAdV无法在水生环境中复制，因此是可靠的污水污染指标。但本研究显示HAdV可能在FLA体内保持活性甚至复制，这意味着在解释检测结果时需要谨慎，类似于环境中大肠杆菌的生长情况。

该研究由新加坡国家研究基金会、加拿大创新基金会、CHIR和阿尔伯塔创新公司等多个机构支持，部分资金来自德国波鸿鲁尔大学RUB研究学院的Gateway奖学金。论文发表在《Water》期刊上，为理解肠道病毒在环境中的持久性和传播机制提供了新的视角，对未来水处理技术改进和公共卫生政策制定具有重要指导意义。