酵母从头生物合成黄芪活性异黄酮毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷的系统工程与代谢调控研究

本研究针对植物来源异黄酮类化合物如毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷(calycosin-7-glucoside)生产受限的问题，通过在酿酒酵母中重构其生物合成途径，结合糖苷水解酶敲除、UDP-葡萄糖供应增强和高活性糖基转移酶筛选等策略，首次实现该化合物的从头生物合成，最终产量达0.22 mg/L，为高价值异黄酮的微生物制造提供创新平台。

　　

在传统中医药宝库中，黄芪（Astragalus membranaceus）作为著名药用植物，其根部含有的异黄酮类化合物具有显著的心血管保护作用。其中毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷（calycosin-7-glucoside）作为关键活性成分，目前主要依赖植物提取获得，但面临生长周期长、分离工艺复杂以及产量有限等瓶颈。虽然毛状根培养和紫外线照射等技术能一定程度提高产量，但仍无法满足规模化生产需求。微生物合成生物学为这些问题提供了新的解决思路，此前工程化酿酒酵母已在 liquiritigenin 和 daidzein 等异黄酮前体生产方面取得重要进展，但毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷的微生物合成尚未实现。

为攻克这一难题，研究人员以先前构建的 daidzein 高产菌株 GYN3 为底盘，通过系统引入来自葛根（Pueraria montana var. lobata）的异黄酮4'-O-甲基转移酶（PlOMT9）、来自黄芪的异黄酮-3'-羟化酶（AmI3'H）和毛蕊异黄酮7-O-葡萄糖基转移酶（AmUCGT），首次在酵母中成功重构了毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷的完整生物合成途径。随后通过多策略优化：敲除内源性糖苷水解酶基因（EXG1 等）、过表达 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGP1）以增强糖供体供应，并筛选获得更高催化活性的糖基转移酶（AmUGT88E29），显著提升了目标产物产量。研究还采用LC-MS代谢组学技术分析途径中间体及代谢通量分布，发现PlOMT9是主要限速步骤，通过优化其基因拷贝数进一步将产量提升至0.22 mg/L。

研究采用的主要技术方法包括：CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术用于基因敲除和整合表达，Gibson组装法构建重组质粒，PEG/ssDNA/LiAc法进行酵母转化，LC-MS多反应监测（MRM）模式进行代谢物定性与定量分析，以及基于产物离子扫描的代谢物结构鉴定。

研究结果部分显示：

在"酵母从头生物合成毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷"中，通过逐步引入PlOMT9、AmI3'H和AmUCGT，成功在工程菌株CAG3中检测到目标产物，但产量较低，表明糖基化是主要瓶颈。

在"解决毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷生物合成中的糖基化瓶颈"中，发现敲除EXG1糖苷水解酶基因和过表达UGP1能提高产量，但最有效的策略是使用高活性糖基转移酶AmUGT88E29替代AmUCGT，使4/3比例从0.0026提升至2.1838。

在"中间体鉴定与途径代谢通量分析"中，通过构建不同酶组合菌株，鉴定出多个途径中间体（5-8），发现AmUGT88E29具有广泛底物特异性，能催化多种异黄酮的糖基化反应。

在"优化途径酶以提高毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷产量"中，基因拷贝数优化表明增加PlOMT9拷贝数最有效，最终菌株CAG17产量最高，而继续增加拷贝数未见进一步改善。

研究结论表明，该工作首次在酵母中实现了毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷的从头生物合成，建立了可扩展的微生物生产平台。研究发现内源性糖苷水解酶EXG1对黄酮类糖苷有水解活性，AmUGT88E29具有广泛的底物 promiscuity（底物混杂性），能催化多种异黄酮的糖基化反应。代谢通量分析揭示PlOMT9是途径主要限速步骤，且大量前体被分流至副产物合成。研究还指出植物中通过酶复合物形成的代谢通道（metabolic channeling）策略值得借鉴，如筛选与异黄酮合酶（IFS）相互作用的甲基转移酶可能有助于提高途径效率。该研究为高价值异黄酮的微生物制造提供了重要技术平台和理论指导，展示了合成生物学在天然产物生产中的巨大潜力。

论文发表于《BioDesign Research》，为植物天然产物的微生物合成提供了创新性解决方案，对促进中医药现代化和天然药物的可持续生产具有重要意义。